铁皮石斛破壁粉工艺参数对质量参数的影响研究

石 雪，唐明华，陈毅坚，黄雕顺

(1.云南品斛堂生物科技有限公司，云南 保山 678300；2.云南师范大学，云南 昆明 650000；3.云南民族大学，云南 昆明 650000；4.黔西南州南盘江国有林场，贵州 兴义 562400)

铁皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo．)是兰科石斛属多年附生草本植物，以新鲜或者干燥茎入药，也叫黑节草[1]。野生铁皮石斛为国家重点二级保护植物。《本草正义》记载：“必以皮色深绿，质地坚实，生嚼之脂膏黏舌，味厚味甘者为上品，名铁皮鲜斛，价亦较贵。”[2]铁皮石斛不仅具有较高的生态价值，而且具有较高的药用价值。《中国药典》一部(2015版)收载石斛质量标准，并将“铁皮石斛标准”单独列出[3]。近年大量药理实验表明，铁皮石斛具有增强免疫力、抗氧化、抗疲劳、降血糖、护肝等作用[4-10]。随着社会经济的发展、人们生活水平的改善、人们对健康认知的加深及人们对铁皮石斛功效认知的不断提升，铁皮石斛产品走进千家万户。过去铁皮石斛的产品多以铁皮石斛、铁皮枫斗、切片、寸金条等原料产品为主，现如今市场需求的扩大给铁皮石斛的发展带来了机遇。截至2019年2月，已获得国家批准的铁皮石斛相关产品包括铁皮石斛胶囊、铁皮石斛颗粒、铁皮枫斗晶等99种[11]。在新的发展机遇下，需要不断丰富铁皮石斛的产品形态。

破壁粉：细胞经破壁粉破壁后更容易被人体吸收到其有效成分，提高利用率。破壁技术的兴起，为铁皮石斛的深加工提供了一种新的思路。接下来需要研究：哪些因数对铁皮石斛破壁粉的生产工艺有影响，铁皮石斛破壁粉生产工艺如何影响铁皮石斛质量参数[12-13]。本研究进行了相关探索，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

铁皮石斛采摘于云南龙陵，经昆明植物研究所杨青松副研究员鉴定为兰科植物铁皮石斛。铁皮石斛植株洗净后，将茎切断，于60 ℃恒温干燥，干燥过程中不间断用快速水分测定仪测定铁皮石斛干料的含水量，将含水量为2%、4%、6%、8%、12%、14%时的样品各取出5 kg；取含水量为12%的干料200g用普通粉碎机进行打粉，全部通过3号筛作为对照样品。D-甘露糖对照品(中检院)(99.4%)，D-无水葡萄糖对照品(中检院)(99.9%)；DL-盐酸氨基葡萄糖(中检院)(100.0%)；色谱纯甲醇(默克)、色谱纯乙腈(默克)、(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)PMP(西格玛)、苯酚、硫酸、无水乙醇、甲醇、氢氧化钠、盐酸、三氯甲烷等试剂均为国药分析纯、娃哈哈纯净水。

1.2 主要仪器

岛津电子分析天平(SHIMADZU)；岛津紫外可见分光光度计(UV-1900型)；岛津(LC2030)高效液相色谱仪；恒温干燥箱；恒温水浴锅；离心机；沃特斯(waters)高效液相色谱柱(型号C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)、卤素水分测定仪(SHIMADZU)、振动式细胞级超微粉碎机(XDW-15B)。

2 方法

2.1 醇溶性浸出物测定

参照《中国药典》一部2015版铁皮石斛醇溶性浸出物测定方法[3]，以95%乙醇为溶剂测定铁皮石斛醇溶性浸出物。

取铁皮石斛样品约3 g，并精密称定，将铁皮石斛置250 mL的锥形瓶中，精密添加95%乙醇100 mL，密塞，精密称定重量，静置1 h，采用冷凝管回流法，加热至沸腾，并保持1 h。放冷至室温，取下锥形瓶，密塞，再称定重量，用95%乙醇补足减失的重量，混匀，过滤，滤液精密量取25 mL，置于干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，在105 ℃干燥箱中干燥3h，置干燥器中冷却30 min，快速精密称定重量。以铁皮石斛干燥品计算醇溶性浸出物的含量(%)。

M1为蒸发皿重量，M2为蒸发皿恒重后重量，M3为铁皮石斛重量，M4为蒸发皿和铁皮石斛重量，M5为蒸发皿和铁皮石斛干燥恒重后重量，X为干燥失重。

2.2 多糖含量测定

参照《中国药典》一部2015版铁皮石斛多糖含量测定方法[3]，以葡萄糖标准品为对照品，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量[14]。

2.2.1 对照品溶液制备方法 精密称定无水葡萄糖对照品0.022 53 g，置于200 mL容量瓶中，用纯化水定容至200 mL所得溶液含葡萄糖为90.1 μg/mL。

2.2.2 标准曲线绘制方法 用移液枪精密量取葡萄糖对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置10 mL具塞比色管中，分别加纯化水补至1.0 mL，精密量取5%苯酚溶液(临用配制)1 mL，混匀，再精密加硫酸5 mL，混匀，放入沸水中加热20 min，取出，放入冰水混合物中冷却5 min，空白试样的制备用纯化水替代葡萄糖对照溶液，在488 nm的波长处测定吸光度(A)。以吸光度(A)为纵坐标(Y)，葡萄糖质量分数为横坐标(X)，绘制标准曲线，得回归方程为Y=17.60X-0.118(R2=1.000 0)。

2.2.3 铁皮石斛样品的制备方法 取铁皮石斛(过3号筛)粉末约0.3 g，精密称定，精密加入纯化水200 mL，回流加热2 h，放冷至室温，将其全部转移至250 mL量瓶中，并少量多次用纯化水洗涤一并转入容量瓶中，用纯化水定容至刻度并摇匀、过滤，精密量取滤液2 mL，放入15 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀冷藏1 h后取出，在转速为4 000 r/min离心20 min，将上清液弃去，所得沉淀加80%乙醇8 mL，共洗涤2次，离心，弃去上清液，沉淀用热水溶解，转移至25 mL容量瓶中，放冷至室温，加纯化水至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 样品测定方法 精密量取铁皮石斛供试品溶液1 mL，置于10 mL具塞比色管中，按照铁皮石斛标准曲线的制备方法制备样品，测定吸光度(A)，用绘制的标准曲线计算葡萄糖的量，即得多糖含量。

2.3 甘露糖含量测定

参照《中国药典》一部2015版铁皮石斛甘露糖含量测定方法[3]，以甘露糖标准品为对照品，采用甘露糖衍生物法测定甘露糖含量[16-18]。

2.3.1 色谱分析条件及系统适用性条件 以乙腈(C2H3N)-0.02mol/L的乙酸铵(C2H7NO2)溶液20∶80为流动相，沃特斯(Waters)高效液相色谱柱(型号C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)；在250nm波长检测条件下。理论塔板数应不低于4 000(按甘露糖峰计算)。

2.3.2 校正因子测定 精密称定DL-盐酸氨基葡萄糖1.200 05 g，置于100 mL容量瓶中，加纯净水使溶解并定容至刻度，摇匀得含DL-盐酸氨基葡萄糖含量为12.000 5 mg /mL的溶液，作为内标溶液。精密量取内标溶液1 mL和精密称定D-甘露糖对照品0.010 2 g，置于100 mL容量瓶中，加入纯净水适量，使溶解并稀释至刻度，摇匀，量取400 μL，加入1-苯基-3-甲基-5-P比唑啉酮(PMP)甲醇溶液(0.5 mol/L)与氢氧化钠溶液(0.3 mol/L)各400 μL，摇匀，于70 ℃恒温水浴锅中反应100 min。再加盐酸溶液500 μL(0.3 mol/L)，摇匀，用三氯甲烷(分析级)2 mL/次洗涤3次，弃去三氯甲烷层，水层在转速为4 000 r/min离心5 min，取上清液1 mL于样品瓶中，10 μL注入高效液相色谱仪，测定，计算校正因子。

表1 校正因子测定

2.3.3 铁皮石斛样品测定法 取铁皮石斛粉末(过3号筛)约0.12 g，精密称定，以80%乙醇为溶剂，索氏提取中加热回流4 h，取出药渣并挥干乙醇，将滤纸和药渣置于烧杯中，加水100 mL，再精密加入DL-盐酸氨基葡萄糖内标溶液2 mL，煎煮并持续搅拌1 h，放至室温，在100 mL容量瓶中定容至刻度，摇匀，离心，精密量取上清液1 mL，置于顶空瓶中，加盐酸溶液0.5 mL 3.0 mol/L，封口，混匀，在110 ℃恒温干燥箱中水解1h，放至室温，用氢氧化钠溶液(3.0 mol/L)调节pH值至中性，精密量取400 μL，照校正因子测定方法制备，自“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”起，操作结束后，取上清液注入高效液相色谱仪，测定，即得。

2.3.4 阴性对照样品 取纯净水400 μL，依据校正因子测定方法，从“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”开始操作，可得。

2.3.5 精密度测试 吸取供试品溶液，按照甘露糖含量测定方法中的色谱条件，进样6次，测定甘露糖的含量，计算结果RSD=0.78%。

2.3.6 稳定性测试 吸取供试品溶液，分别于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h时，按照甘露糖含量测定方法中的色谱条件，测定甘露糖的含量，计算结果RSD=0.94%，说明甘露糖的衍生物在24 h内稳定。

2.3.7 重复性测试 取相同来源药材，按照甘露糖含量测定方法平行制备供试品溶液6份，按照甘露糖含量测定色谱条件分别进样，检测甘露糖的含量，计算结果RSD=1.78%(n=6)。

2.3.8 加样回收测试 精密称取已知甘露糖含量的铁皮石斛样品6份，准确加入相同量的标准品(甘露糖)，按照甘露糖含量测定的方法，制备供试品溶液，测定结果回收率为99.60%，RSD为1.75%。

表2 加样回收试验结果

2.4 甘露糖与葡萄糖峰面积比测定

参照《中国药典》一部2015版铁皮石斛中甘露糖/葡萄糖峰面积比测定方法进行测定。取D-无水葡萄糖对照品精密称定0.010 04 mg，置于200 mL容量瓶中，加纯净水使溶解并定容至刻度得D-无水葡萄糖50 μg/mL的对照品溶液。按照甘露糖含量测定方法测定，计算甘露糖/葡萄糖峰面积比值。

3 样品含量测定

3.1 铁皮石斛含水量对铁皮石斛破壁粉工艺和质量的影响

取含水量为2%、4%、6%、8%、12%、14%铁皮干料各200g，在振动式细胞级超微粉碎机(XDW-15B)-15 ℃条件下粉碎30 min。取出样品分别编号，分别按“2”下项方法制备供试品并计算测定，不同样品测定分析及计算结果见表3。

表3 铁皮石斛含水量对铁皮石斛破壁粉工艺及质量参数的影响

由表3可知：普通粉碎机与振动式细胞级超微粉碎机对铁皮石斛粉碎后，对甘露糖含量测定结果无影响；对浸出物、多糖、甘露糖与葡萄糖峰面积比测定结果差异显著。振动式细胞级超微粉碎机在相同的粉碎温度(-15 ℃)、粉碎时间(30 min)的条件下对不同含水量的铁皮石斛粉碎测定结果表明：甘露糖的相对标准偏差(1.6%)<多糖的相对标准偏差(7.8%)<浸出物的相对标准偏差(11.9%)<甘露糖与葡萄糖峰面积比的相对标准偏差(31.7%)。甘露糖含量的测定结果与铁皮石斛含水量没有关系；浸出物含量随着铁皮石斛含水量的降低而升高；多糖测定结果随着水分的降低而增加；浸出物随着水分的降低而增加；甘露糖与葡萄糖峰面积比随着水分的降低而降低。

3.2 铁皮石斛粉碎时间对铁皮石斛破壁粉工艺和质量的影响

取含水量6%铁皮干料1 200 g平均分成6份，在振动式细胞级超微粉碎机(XDW-15B)-15 ℃条件下粉碎5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。取出样品分别编号，分别按“2”项方法制备供试品并计算测定，不同样品测定分析及计算结果见表4。

表4 铁皮石斛粉碎时间对铁皮石斛破壁粉工艺及质量参数的影响

由表4可知：普通粉碎机与振动式细胞级超微粉碎机对铁皮石斛粉碎后，对甘露糖含量测定结果无影响；对浸出物、多糖、甘露糖与葡萄糖峰面积比测定结果差异显著。振动式细胞级超微粉碎机在相同的粉碎温度(-15 ℃)、含水量(6%)的条件下对铁皮石斛粉碎不同粉碎时间测定结果表明：甘露糖的相对标准偏差(2.3%)<多糖的相对标准偏差(8.6%)<浸出物的相对标准偏差(13.0%)<甘露糖与葡萄糖峰面积比的相对标准偏差为(32.4%)。甘露糖含量的测定结果与铁皮石斛粉碎温度没有关系；浸出物含量随着铁皮石斛粉碎温度的降低而升高；多糖测定结果随着粉碎温度的降低而增加；浸出物随着粉碎温度的降低而增加；甘露糖与葡萄糖峰面积比随着粉碎温度的降低而降低。

3.3 铁皮石斛粉碎温度对铁皮石斛破壁粉工艺和质量的影响

取含水量6%铁皮石斛干料1 200 g平均分成6份，在振动式细胞级超微粉碎机(XDW-15B)温度为25 ℃、15 ℃、5 ℃-5 ℃、-15 ℃、-25 ℃的条件下粉碎30 min。取出样品分别编号，分别按“2”项方法制备供试品并计算测定，不同样品测定分析及计算结果见表5。

表5 铁皮石斛粉碎温度对铁皮石斛破壁粉工艺及质量参数的影响

由表5可知：普通粉碎机与振动式细胞级超微粉碎机对铁皮石斛粉碎后，对甘露糖含量测定结果无影响；对浸出物、多糖、甘露糖与葡萄糖峰面积比测定结果差异显著。振动式细胞级超微粉碎机在相同的粉碎时间(30 min)、含水量(6%)的条件下对铁皮石斛粉碎不同粉碎温度测定结果表明：甘露糖的相对标准偏差(1.3%)<多糖的相对标准偏差(7.6%)<浸出物的相对标准偏差(10.3%)<甘露糖与葡萄糖峰面积比的相对标准偏差为(28.9%)。甘露糖含量的测定结果与铁皮石斛粉碎温度没有关系；浸出物含量随着铁皮石斛粉碎温度的降低升高；多糖测定结果随着粉碎温度的降低增加；浸出物随着粉碎温度的降低增加；甘露糖与葡萄糖峰面积比随着粉碎温度的降低而降低。

4 讨论

铁皮石斛在振动式细胞级超微粉碎机粉碎所得粉的质量参数随着铁皮石斛粉碎的工艺参数含水量、粉碎时间、粉碎温度的影响而变化。粉碎的工艺参数对甘露糖含量的测结果没有影响；浸出物、多糖随着含水量的降低而增加、粉碎时间的增加而增加、粉碎温度的降低而增加；甘露糖与葡萄糖峰面积比随着含水量的降低而减小、粉碎时间的增加而减小、粉碎温度的降低而减小。可以看出：铁皮石斛含水量、粉碎时间、粉碎温度是铁皮石斛破壁粉生产工艺的关键工艺参数，含水量越低、粉碎时间越长、粉碎温度越低越有利于铁皮石斛破壁；但当含水量小于等于8%、粉碎时间超过30 min、温度低于-5 ℃时影响趋于稳定。

铁皮石斛经过振动式细胞级超微粉碎机粉碎后甘露糖含量保持不变；浸出物、多糖测定结果增加；甘露糖与葡萄糖峰面积比减小，说明铁皮石斛粉碎工艺对铁皮石斛质量参数有显著影响。

铁皮石斛经过破壁粉碎后质量参数差异显著，有效成分多糖、浸出物含量增加，破壁后多糖有效成分更有利于溶解出来，甘露糖含量保持一致，破壁粉浸出物升高使得葡萄糖含量增加，从而导致甘露糖与葡萄糖峰面积减小。铁皮石斛的有效成分主要为糖类，铁皮石斛的破壁对检测结果影响显著。

本研究结果与《中国药典》一部(2015版)记载相符，但铁皮石斛原料经过破壁处理后，浸出物、多糖、甘露糖/葡萄糖峰面积比检测指标发生了显著变化；更多的有效成分被溶解检出，说明对铁皮石斛进行破壁深加工处理的研究有实际应用价值。后期仍需对破壁粉的深加工工艺和质量标准进行深入研究。醇溶性浸出物、多糖及甘露糖/葡萄糖峰面积比可作为研究铁皮石斛破壁粉工艺研究和工艺优化的检测指标。