青蒿含量测定方法及其性状与成分关系研究

张 媛，李瑞海，贾天柱

(辽宁中医药大学 药学院，辽宁 大连 116600)

青蒿为菊科植物黄花蒿(ArtemisiaannuaL.)的干燥地上部分[1]，具有清热、解暑、截疟、凉血、利尿、止盗汗等功效[2]。现代药理研究表明，倍半萜、香豆素、挥发油、黄酮等物质是青蒿所含的主要成分[3]，其中青蒿素作为青蒿最有效的抗疟成分已经被业界认可。纪晓光等[4]通过鼠疟模型研究青蒿的化学成分与青蒿素配伍的药效学实验发现，青蒿酸和东莨菪内酯对于青蒿素的抗疟药效具有很强的增效作用。药理研究表明东莨菪内酯在抗炎、抗肿瘤、降压等方面也有很好的疗效[5]。目前2015版《中国药典》尚无青蒿的主要成分含量测定方法，因此本研究选取青蒿素、青蒿酸和东莨菪内酯3种成分作为含测指标成分，对于青蒿质控具有一定意义。本研究收集16个产地不同青蒿样品，对青蒿进行含量测定，并对其主要成分和性状之间的关系进行初步研究，以期从性状描述反映药材青蒿内在成分质量的规律。

1 仪器、试剂

1.1 仪器

1100 Series 系列高效液相色谱仪(美国安捷伦科技公司，安捷伦色谱工作站)；HH-4 型数显恒温水浴锅(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；SF-130B 型高速粉碎机(上海冠联制药装备有限公司)；AS3120 型超声提取器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司)；CP225D 型 十万分之一电子天平(Sartorius)等。

1.2 试剂

东莨菪内酯对照品(批号：190609)、青蒿素对照品(批号：190618)、青蒿酸对照品(批号：190506)购于大连美仑生物技术有限公司；甲醇、乙腈(色谱纯，西陇科学股份有限公司)；水为纯净水；各批青蒿药材购于全国各地(见表1)，经辽宁中医药大学药学院许亮教授鉴定为黄花蒿的地上部分。

表1 青蒿样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱(WelchPolarRP)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸缓冲溶液(B)，梯度洗脱(0～30 min，10%～55%A；30～38 min，55%～75%A；38～42 min，75%～90%A)；检测波长220 nm；流速1 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量20 μL。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液制备 精密称取对照品东莨菪内酯、青蒿素、青蒿酸，加甲醇配制成每毫升含东莨菪内酯0.10 mg、青蒿素9.2 mg、青蒿酸0.52 mg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约1 g，精确称定，置圆底烧瓶中，精密加入乙醇60 mL，称重，回流2 h，放冷，再称重，用乙醇补足减失的质量，过滤，取续滤液挥发至干，残渣用甲醇溶解转移并定容至25 mL容量瓶中，经0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3 专属性实验

精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液各20 μL，按“2.1”项下的色谱条件测定，结果对照品的分离度良好，且与供试品中的其他成分无干扰，见图1。

2.4 标准曲线的绘制

精密吸取混合对照品溶液(东莨菪内酯2.75 mg/mL、青蒿素13.25 mg/mL、青蒿酸4.105 mg/mL)，0.10 mL、2.0 mL、4.0 mL、6.0 mL、8.0 mL、10.0 mL和20.0 mL至25 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，按“2.1”项下色谱条件测定峰面积。以对照品进样量X(μg)为横坐标，峰面积值为纵坐标Y，得回归方程及线性范围见表2，结果表明东莨菪内酯、青蒿酸、青蒿素对照品有良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取混合对照品20 μL，连续进样6次，测定峰面积，测得3种对照品的峰面积RSD分别为1.2%、0.5%、0.52%，说明本试验精密度良好。

1.东莨菪内酯；2.青蒿素；3.青蒿酸；A.混合对照品；B.供试品

表2 各成分的回归方程及线性范围

2.6 重复性试验

取1号样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行HPLC测定，结果3种对照品的含量RSD(n=3)分别为1.5%、0.9%、1.4%，说明本方法重复性良好。

2.7 稳定性试验

取1号供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、2 4h进样测定，结果3种对照品的峰面积RSD(n=3)分别为2.1%、1.6%、2.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收试验

取1号样品粉末6份，每份0.5 g，精密称定，分别按样品含量-对照品(1∶1)加入东莨菪内酯1.159 0 mg/mL、青蒿素6.056 0 mg/mL、青蒿酸2.044 0 mg/mL各1mL，按“2.3”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件进行HPLC测定，计算回收率，结果回收率分别为100.0%、99.7%、98.9%，RSD分别为1.5%、1.1%、2.2%，符合相关规定。

2.9 青蒿不同性状样品中主要成分的含量测定

2.9.1 含量测定结果 根据《中国药典》规定，青蒿茎直径为0.2～0.8 cm，本实验将每批青蒿饮片样品的茎根据粗细划分成三类(组一)：粗茎(>0.8 cm)、中粗茎(0.2～0.8 cm)、细茎(<0.2 cm)；按照茎叶破碎程度将每批样品划分成两类(组二)：完整茎叶、破碎茎叶。按“2.2.2”项下制备方法进行制备，“2.1”项下色谱条件测定，结果见表3。

2.9.2 含量测定结果分析 通过所得的实验数据直观来看，不同粗细程度的青蒿茎中，东莨菪内酯的含量差别较大；不同破碎程度的茎叶中倍半萜类成分的含量也有所差异，为进一步探究组间差异性的显著性，将所得结果用SPSS 17.0进行数据分析。结果见表4、表5、表6。

表3 不同粗细程度的茎中东莨菪内酯含量 (mg·g-1)

表4 不同直径青蒿茎中东莨菪内酯含量方差分析结果 (n=16)

表5 多重比较结果

表6 不同破碎程度青蒿茎叶中萜类含量的t检验结果 (n=16)

3 讨论

实验初期对提取溶剂和提取方式进行了考察，比较了不同浓度的乙醇、甲醇通过超声和回流提取青蒿药材的HPLC色谱，其中以乙醇为提取溶剂，回流2 h的色谱峰较多，且峰形好，提取效果最好，故本实验最终确定用乙醇回流提取。

根据前期对青蒿不同部位含量测定的结果得知，东莨菪内酯主要存在于青蒿的茎中，在青蒿的叶和果实中含量甚微；而青蒿酸和青蒿素这两种倍半萜类成分大量存在于青蒿的叶和果实中，在青蒿的茎中含量较少，因此本次研究选取东莨菪内酯的含量作为比较组一间差异的指标成分，选取青蒿素和青蒿酸的含量之和作为比较组二间差异的指标成分。

从SPSS分析结果来看，组一的P=0.009<0.05，而组二的P=0.267，可以认为不同直径的青蒿茎中，东莨菪内酯的含量有显著性差异；而在破碎程度不同的青蒿茎叶中，倍半萜含量的差异性并不显著。在此之后对组一项下的3组进行多重比较，细茎(<0.2 cm)和粗茎(>0.8 cm)两组的指标成分含量的差异最显著，其P=0.02。由此可以得出结论，直径<0.2 cm的青蒿饮片东莨菪内酯的含量最高，可以将此作为判断青蒿饮片质量的依据之一，而青蒿茎叶的破碎程度也可作为判断其质量的辅助条件。从实验结果来看，本研究初步建立了青蒿外在性状与内在质量间的联系，可以认为茎越细、破碎叶子越多的青蒿有效成分含量越高。

2015版《中国药典》虽然增加了理化指标和现代分析技术，但只能评判药材是否合格，并不能对其优劣进行区分；而当今常用的药材已有600多种，现行的药材商品规格标准只对76种中药材进行了规格、等级的划分，显然远远不能满足如今的市场需求。将传统鉴别方法与现代科学技术结合起来，将主观性和客观性结合起来是值得进一步研究的课题。