活血祛瘀巴布剂体外释放度及离体小鼠经皮渗透行为与动力学考察*

杨全伟，张耕，胡松

(武汉市第一医院药学部，武汉 430022)

活血祛瘀巴布剂由丹参、骨碎补、赤芍、五加皮、牡丹皮、红花、甘草等7味中药组成，为我院中医科临床使用多年的协定处方，目前临床应用时将其处方饮片药材打粉，蜂蜜调和，贴敷，临床疗效确切，深受患者认可。笔者在本实验考察活血祛瘀巴布剂透皮性能，选择君药丹参中丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸以及丹酚酸B 5种主要有效成分为检测指标，考察其体外释放度、离体透皮率及制备的巴布剂动力学释放行为，现报道如下。

1 仪器与试药

1.1仪器 ME215S电子分析天平(Sartorius公司，Max210 g，d=0.01 mg)；Essentia LC-16高效液相色谱仪(日本岛津公司，自动进样器，紫外检测器：SPD-20A)；RYJ-6A型药物透皮扩散试验仪(上海黄海药检仪器厂)；超纯水机(上海惠分科学分析仪器有限公司)；KQ-300DE型医用数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.3实验动物 清洁级小鼠，体质量(20±5)g，由湖北省疾病预防控制中心动物实验室提供，实验动物合格证号：NO.4200695787，实验动物许可证号：SCXK(鄂)2019-0030。屏蔽环境饲养，普通维持饲料，自由饮水。室温(22±3) ℃，相对湿度(55±5)%，12 h光照黑暗循环。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱C18分析柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，采用梯度洗脱方法，具体洗脱流程见表1；流速：1.0 mL·min-1；进样量：10 μL；柱温30 ℃；检测波长287 nm。

表1 梯度洗脱程序

2.2样品的制备

2.2.1对照品溶液 精密称取各对照品，置5个50 mL量瓶，70%甲醇溶解，制成丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B含量分别为0.108，0.1026，0.1248，0.1516，0.1646 mg·mL-1贮备液，精密量取上述5个对照品溶液5 mL，置50 mL量瓶，加70%甲醇定容至刻度，摇匀，过滤，即为混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液 按活血祛瘀巴布剂处方称取药材，加30%乙醇渗漉提取，所得药液减压浓缩成流浸膏，备用。称取聚丙烯酸钠，加甘油搅拌溶解，加入活血祛瘀巴布剂流浸膏，加入明胶胶体液溶胀，加入氮酮，搅拌熟化，摊涂。晾干，按规格切割成片，密封袋保存。

取活血祛瘀巴布剂一贴(批号：19081501)，除去盖衬，取膏体约0.4 g，精密称定，置100 mL锥形瓶，密封，精密加入60%乙醇50 mL，称质量，超声处理15 min(120 W，频率40 kHz)，放冷，用60%乙醇补质量，过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

2.2.3阴性溶液 按活血祛瘀巴布剂处方，称取除丹参外的其他药材，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备，过滤，续滤液即为阴性溶液。

汉英学习型词典形容词条目译义语境化描写 ……………………………………………………… 秦 曦（5.34）

2.3方法学考察

2.3.1专属性考察 按“2.1”项色谱条件，分别取混合对照品溶液(丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B对照品浓度分别为0.010 8，0.010 26，0.012 48，0.015 16，0.016 46 mg·mL-1)、供试品溶液、阴性溶液，分别进样10 μL检测，得色谱图，见图1。由图1可见，供试品各指标组分与对照品组分保持一致，同时组分间均可以实现很好分离，分离度大于1.5，理论塔板数大于3000，阴性样品无干扰。

1.丹参素钠；2.原儿茶醛；3.阿魏酸；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B。

2.3.2线性关系考察 分别取“2.2.1”项5个对照品贮备液，按“2.1”项色谱条件，分别进样1，2，4，8，10，20 μL，记录峰面积，以进样含量为横坐标(X)，以峰面积为纵坐标(Y)，分别计算线性回归方程，结果见表2，各组分在其范围内线性关系符合标准。

表2 各组分线性关系

2.3.3精密度实验 取“2.2.1”项混合对照品溶液，按“2.1”项色谱条件，连续进样6次，每次进样10 μL，计算得丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B峰面积RSD分别为0.23%，0.72%，0.89%，1.04%，1.15%，表明仪器精密度良好。

2.3.4稳定性实验 取活血祛瘀巴布剂一贴(批号：19081501)，除去盖衬，取膏体约0.4 g，精密称定，置100 mL锥形瓶，密封，精密加入60%乙醇50 mL，称质量，超声处理15 min(120 W，频率40 kHz)，放冷，称质量，加60%乙醇补充质量，过滤，取续滤液，按“2.1”项色谱条件，分别于1，2，4，8，12，24 h进样10 μL，计算6个时间点丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量，与0 h样品含量进行比较，计算得RSD<1%，说明样品24 h基本无降解； 5种组分峰面积RSD分别为1.27%，1.44%，0.96%，1.36%，1.75%，表明溶液24 h内稳定性良好。

2.3.5重复性实验 取活血祛瘀巴布剂(批号：19081501)，除去盖衬，取6份膏体，每份约0.4 g，精密称定，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备，在“2.1”项色谱条件下分别进样10 μL，计算得丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量分别为212.39，132.532，373.04，408.044，554.42 μg，RSD分别为1.83%，1.90%，1.99%，1.48%，1.20%，表明该方法重复性良好。

2.3.6加样回收率实验 见表3。取活血祛瘀巴布剂(批号：19081501)，除去盖衬，分别称取6份膏体，每份约0.2 g，精密称定，分别加入丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B混合对照品溶液适量，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备，在“2.1”项色谱条件下，分别进样10 μL，计算丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量，计算加样回收率，结果RSD分别为1.17%(n=6)、1.28%(n=6)、1.02%(n=6)、0.38(n=6)、0.68%(n=6)，表明该实验结果良好，数据可靠，方法可行。

表3 6种成分加样回收率实验结果

2.4样品含量测定 取活血祛瘀巴布剂3批(批号：19081501，19081502，19081503)，按“2.2.2”项供试品溶液制备方法制备，按“2.1”项色谱条件，分别进样10 μL，测定丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果

2.5释放度实验 按2015年版《中华人民共和国药典》(四部)项下通则0931关于溶出度与释放度测定法第四法桨碟法进行操作[1-2]：取不锈钢筛网(孔径2 mm×2 mm)制成2个网碟，精确称取活血祛瘀巴布剂0.4 g，将其用2个网碟固定，同时使巴布剂药面朝上，置于500 mL烧杯中部，加入37 ℃0.9%氯化钠溶液500 mL，保持恒温，用搅拌桨匀速搅拌，分别于30，60，90，120，150，180 min精密吸取溶液100 mL，取样后再分别注入37 ℃0.9%氯化钠溶液100 mL。

2.5.1供试品溶液的制备 分别将6个时间段接收液分别置水浴锅蒸干，用60%甲醇溶液溶解，转移至1 mL量瓶，并定容至刻度、摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.5.2释放度测定结果 将上述6个时间段制备的样品溶液，按照上述“2.1”项色谱条件，分别进样10 μL，记录峰面积，计算释放含量，结果见图2。

图2 活血祛瘀巴布剂离体释放度实验结果

2.6离体小鼠透皮率测定 取清洁级小鼠，脱颈处死，电动剃刀将腹部脱毛，脱毛过程中不损害外部皮肤，酒精消毒，从腹部剪开皮肤，0.9%氯化钠溶液清洗[3-5]。采用改良Franz扩散池，将腹部鼠皮朝下，腹部内皮层朝上，置于接收池上，称取活血祛瘀巴布剂0.40 g，精密称定，贴敷于老鼠皮部，将接收池内加满0.9%氯化钠溶液，水浴恒温保持(37±1)℃，开启磁力搅拌(搅拌速度200 r·min-1)，分别于1，2，4，8，12，24 h，取出接收池中接收液，同时补充同量恒温0.9%氯化钠溶液(37±1 ℃)。

2.6.1活血祛瘀巴布剂透皮供试品溶液的制备 分别将6个时间段的接收液置水浴锅蒸干，60%甲醇溶解，转移至1 mL量瓶，并定容至刻度、摇匀，过滤，取续滤液即得。

2.6.2离体透皮率含量测定 将上述制备的样品，按“2.1”项色谱条件注入高效液相色谱仪，分别进样10 μL检测，计算样品中丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量及经皮渗透动力学拟合，活血祛瘀巴布剂(0.400 0 g)中含有丹参素钠212.923 μg、原儿茶醛132.532 μg、阿魏酸373.204 μg、迷迭香酸408.044 μg、丹酚酸B554.42 μg，结果见图3和表5。

图3 活血祛瘀巴布剂中丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B累积透皮量-时间变化曲线

2.7结果 由表5结果可知，活血祛瘀巴布剂中丹参素钠经皮渗透动力学拟合方程符合Higuchi方程，拟合度为0.934；原儿茶醛透皮动力学拟合方程中，拟合度最高为0.943，符合Higuchi方程；阿魏酸经皮渗透动力学拟合方程中，符合Higuchi方程，拟合度为0.973；迷迭香酸经皮渗透动力学拟合方程中，符合Higuchi方程，拟合度为0.961；丹酚酸B动力学拟合方程中，拟合度最高为0.975，符合Higuchi方程。

由图5结果可知，活血祛瘀巴布剂中离体小鼠透皮率，5种有效组分含量均为逐步缓慢释放，在皮肤角质层进行贮库蓄积，从而进行低速运输，表明该制剂为骨架型缓释制剂[6-7]。

表5 经皮渗透动力学拟合方程

3 讨论

活血祛瘀巴布剂具有行气活血化瘀、通络止痛的功效。本实验选择丹参中水溶性有效成分丹参素钠、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸、丹酚酸B进行含量测定，考察指标成分均对骨疾病有良好药理功效，其中丹参素钠具有抑制破骨细胞成熟和活化，减少骨组织吸收、破坏[8]，上皮分化因子通过骨保护素和核因子-κB活化受体配体调控破骨细胞；原儿茶醛能明显改善模型动物骨物理指标，增加骨密度、骨矿物质和有机质，增强各重要器官质量比(器官质量/体质量)，从而有效防治醋酸泼尼松所致骨质疏松[9]；阿魏酸可以在骨折愈合初期血肿机化期，通过加快微循环血流速度，增加毛细血管网的通透性，改善骨折断端局部血液循环，清除血凝块及代谢产物，促进骨折愈合[10]；迷迭香酸通过线粒体途径诱导线粒体产生细胞色素C，引起激活T细胞凋亡[11]；丹酚酸B可用于防治糖皮质激素所致松质骨骨量丢失，有效抑制人骨髓间充质干细胞分化、矿化[12]。

对所考察的含量测定指标成分，通过紫外分光光度仪进行最佳波长选择，发现吸收波长为287 nm时，各组分均有良好响应吸收峰，故确定最佳吸收波长为287 nm。选择流动相时，考察了甲醇-0.1%磷酸，乙腈-0.1%磷酸，甲醇-0.1%醋酸等不同流动相系统进行洗脱，采用乙腈-0.1%磷酸时，峰形较好，采用该流动相进行梯度条件的筛选，最终确定最佳梯度洗脱流动相。

笔者在本实验制备的巴布剂通过释药动学拟合，发现该药为骨架型透皮制剂，骨架型透皮吸收制剂是药物分散在聚合物骨架中，由骨架的组成成分来控制药物的释放。骨架型透皮贴比贮库型更薄更小，而且皮肤刺激性小，因此患者的顺应性更好，为目前药物经皮领域研究的热点[13]。巴布剂中有效成分的释放较为缓慢、平稳，从而可有效地避免血药浓度的明显波动，减少血药浓度“峰谷”现象，减少患者因血药浓度过高而发生的不良反应。制备的活血祛瘀巴布剂缓控释制剂可实现药物释放的定时、定位、定速，从而可使药物发挥出更好的疗效。