关岭牛多种寄生虫混合感染病例的实验室诊断与治疗

徐 雨， 冯明祥， 韦登雄， 图 雅， 刘 苹， 杨和俊， 陈永翠

(贵州省关岭布依族苗族自治县动物疫病预防控制中心，贵州 关岭 561300)

寄生虫病是牛的三大疾病之一，常见的牛寄生虫有线虫、吸虫、绦虫、球虫和血液原虫等。动物感染寄生虫后多呈慢性消耗性经过，临床表现为消瘦、水肿、贫血、便秘下痢交替发生，最后因恶病质而死亡，造成很大的经济损失[1～3]。2020年4月，关岭布依族苗族自治县某联保户养殖关岭牛3头，出现不明原因消瘦，被毛凌乱，排茶色尿，疑似寄生虫感染。为查明原因，对牛进行采样检测，根据检测结果进行针对性治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 检测病料采集3头牛的粪便、血液(颈静脉采集全血，-20 ℃冻存)各1份。

1.1.2 主要试剂与仪器尼龙兜(60目和120目)、玻片、染色缸、生物显微镜、无菌采血管；吉姆萨染色试剂(Solarbio)、2×TaqMaster Mix试剂(康为世纪生物科技有限公司)、琼脂糖粉(Amresco)、D 5000 DNA Ladder(Biomiga)、GoldView核酸染料(Solarbio)、天根DP318-02血液基因组DNA提取试剂盒(北京诺博莱德科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 虫卵检查按照尼龙兜集卵法[4，5]收集虫卵后，显微镜检查虫卵形态、大小，鉴定虫卵种类。

1.2.2 血液原虫检查制作血液推片，自然干燥后甲醇固定5 min，10%吉姆萨染色，24 h后清水冲洗，晾干镜检[6]。

1.2.3 血液原虫PCR鉴定按照GenBank发表的相关血液原虫序列设计引物，双芽巴贝斯虫引物参照相关文献[6，7](见表1)。

表1 引物序列

将采集的3份血液分别标记为1～3号，用血液基因组DNA提取试剂盒提取DNA，进行PCR扩增。附红细胞体和双芽巴贝斯虫检测选用同一反应体系。反应体系10 μL：2×TaqMaster Mix 5 μL，上、下游引物(10 pmol/μL)各0.2 μL，DNA模板0.2 μL，ddH2O 4.4 μL。扩增条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变 性 30 s，60 ℃ 退 火30 s，72 ℃ 延 伸60 s，共 35个循环；72 ℃ 再延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，观察结果，并送生工生物公司测序。

1.2.4 治疗根据检测结果明确牛感染寄生虫种类后，选取针对性药物进行治疗，并于14 d后再次进行寄生虫检测。

2 结果

2.1 虫卵检查在粪便中检查到线虫卵(长径90 μm，宽径40 μm左右)和吸虫卵(长径150 μm，宽径80 μm左右)，见图1。未检出绦虫卵和球虫卵囊。

a：线虫卵 b：线虫卵 c：吸虫卵图1 虫卵镜检结果(10×40)

2.2 血推片检查染色镜检可见红细胞内含2个紫色点状虫体，疑似双芽巴贝斯虫(见图2)。

图2 血推片染色镜检结果(10×100)

2.3 血液原虫PCR鉴定由图3可见：1号血液样品附红细胞体呈阳性，PCR扩增条带为800 bp左右；1～3号血液样品双芽巴贝斯虫呈阳性，PCR扩增条带为1 800 bp左右。阳性产物送生工生物公司测序确定为附红细胞体和双芽巴贝斯虫。

3 结论

通过粪便虫卵检查、血推片检查和血液原虫PCR鉴定，诊断患病牛为线虫、吸虫、附红细胞体、双芽巴贝斯虫混合感染。

M：5 000 DNA Marker； 1～3：各样品附红细胞体PCR检测；4～6：各样品双芽巴贝斯虫PCR检测图3 血液原虫PCR检测结果

4 治疗

(1)血液原虫：贝尼尔(血虫净)5 mg/kg体重，用灭菌蒸馏水配成5%溶液，臀部深层肌肉注射，间隔48 h 后再注射1次。用0.5%敌百虫喷洒牛体和圈舍，15 d后再次喷洒。(2)线虫和吸虫：氯氰碘柳胺钠注射液2.5 mg/kg体重，皮下(或肌肉)注射(肌注药物间隔3 d分开使用)。14 d后再次采集粪便和血液，未检测到相应虫卵、虫体。

5 讨论

该养殖户饲养的3头牛长期消瘦，被毛凌乱，从未进行过驱虫，并一直放牧饲养，加上春季是寄生虫病高发时期，导致多种寄生虫混合感染。线虫、吸虫是牛消化道的主要寄生虫，在宿主体内长期掠夺营养，导致消瘦，并对消化道造成机械性损伤。血液原虫病破坏红细胞，造成贫血、黄疸、茶色尿等明显临床症状，同样长期摄取寄主能量，影响生长。经针对性用药治疗后，复查未见虫体，2个月后牛生长恢复正常，证明治疗药物有效。