一株鹅源鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

杨殿江， 蒲 龄， 向小英 ， 李培珍， 徐景峨， 张亚楠， 陶宇航， 韩 雪， 杨 莉

(1. 湖南省芷江侗族自治县畜牧水产事务中心，湖南 芷江 419100； 2. 贵州省农业科学院畜牧兽医研究所，贵州 贵阳 550005)

鸭疫里氏杆菌病(或鸭疫里默氏杆菌病)是由鸭疫里氏杆菌 (Riemerellaanatipestifer， RA)感染引起的1种细菌性传染病， 又名鸭传染性浆膜炎、新鸭病、鸭败血病、鸭疫综合征，主要感染1～8周龄的水禽，病死率可高达80%[1，2]。临床表现弓角反张、共济失调、行动迟缓，眼鼻流出黏液性分泌物，拉绿色或黄白色稀粪等症状；病理变化主要为纤维素性心包炎、肝周炎、气囊混浊[3～5]。国际上将RA分为21个血清型，其中1型和2型是我国主要流行的血清型[6]。此外各地区、各养殖场流行的血清型也不尽相同，呈多血清型感染流行态势[7，8]，甚至同1个场有2种以上的血清型感染。由于各血清型之间没有交叉保护，给疫苗的研制带来极大困难，且抗生素的滥用加剧了耐药菌株的产生，使鸭疫里氏杆菌病的防控工作艰巨，给养殖业造成很大的经济损失。2020年4月，湖南省芷江侗族自治县某鹅场的10日龄雏鹅出现精神萎靡、食欲下降，排绿色稀粪，部分出现神经症状，病死率30%。解剖病鹅可见肝脏表面有1层白色薄纤维素性膜；心包膜增厚，有纤维素样物渗出。经贵州省畜牧兽医研究所畜禽疫病研究室检测诊断为鸭疫里氏杆菌病。现将诊断情况报道如下，供参考。

1 材料与方法

1.1 检测病料无菌采集5只病鹅的脑、心脏、肝脏组织作为检测病料。

1.2 培养基与试剂胰蛋白胨大豆琼脂培养基、胰蛋白胨大豆肉汤培养基、酵母浸出物、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、甘露醇盐琼脂培养基(购自青岛海博生物技术有限公司)，新生牛血清(购自浙江天杭微生物科技股份有限公司)，2×Es MasterMix(购自北京世纪康为生物科技有限公司)，核酸染料(购自北京索莱宝科技有限公司)。

1.3 细菌分离与鉴定

1.3.1 细菌分离培养将无菌采集的病鹅脑、心脏、肝脏病料分别划线接种至含5%新生牛血清、0.5%酵母浸出物的胰蛋白胨大豆琼脂培养基，置于CO2培养箱37 ℃培养24～36 h。挑取生长的单个菌落分别接种至含5%新生牛血清和0.5%酵母浸出物的胰蛋白胨大豆肉汤培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、甘露醇盐琼脂培养基，37 ℃ 16 h 纯化培养，观察菌落生长情况。

1.3.2 染色镜检挑取纯化后的菌落进行革兰氏染色镜检，观察细菌形态。

1.3.3 PCR鉴定用水煮法提取分离菌的DNA，根据GenBank登录的鸭疫里氏杆菌ompA基因序列为(登录号：KY399243.1)设计引物。引物序列为F：5’-ACTCCGCCATTGTCTAAG-3’；R：5’-CCGT CACCATCTGTATCT-3’。预扩增PCR产物长度584 bp。PCR扩增体系：2×Es MasterMix 12.5 μL，DNA 2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 加至 25 μL；同时设置阳性对照和阴性对照。PCR反应程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，扩增30个循环；72 ℃延伸10 min。最后将PCR产物进行1%核酸琼脂糖凝胶电泳，初步确定是否为目的条带。将PCR扩增产物送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果在NCBI网站上进行BLAST比对分析。

1.3.4 药敏试验参照WHO推荐的K-B纸片法对分离菌进行药敏试验，以大肠杆菌ATCC 25922为质控菌株，结果按NCCLS标准做出判定。

2 结果

2.1 细菌分离培养、染色镜检接种病料在含新生牛血清和酵母的胰蛋白胨大豆琼脂培养基上生长出圆形、半透明、水润、光滑、直径2～3 mm的菌落(见图1)。在麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、甘露醇盐琼脂培养基无菌落生长。对分离菌株进行革兰氏染色镜检，可见红色、无芽孢的革兰氏阴性小杆菌(见图2)。

图1 胰蛋白胨大豆琼脂培养基生长菌落

图2 分离菌革兰氏染色镜检

2.2 PCR鉴定经PCR扩增，分离菌株在584 bp处出现清晰条带(见图3)。PCR扩增产物测序结果与GenBank报道的RA序列同源性达99%，鉴定该分离菌株为鸭疫里氏杆菌(命名为RAZJ01)。

M：DL 2 000 DNA Marker； 1：分离菌PCR产物； 2：阳性对照； 3：阴性对照图3 分离菌株PCR扩增电泳

2.3 药敏试验由表1 可见：分离菌株对头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻呋、阿莫西林、氨苄西林敏感；对氟苯尼考、恩诺沙星中度敏感；对青毒素G、环丙沙星、氧氟沙星、强力霉素、卡那霉素、阿米卡星、磺胺异恶唑、链霉素耐药。

表1 药敏试验结果

3 结论

3.1本试验通过对发病雏鹅病料进行细菌分离培养、染色镜检、PCR鉴定，确定分离菌株为鹅源鸭疫里氏杆菌(命名为RAZJ01)，结合发病鹅临床症状、病理变化，确诊为鸭疫里氏杆菌病。

3.2药敏试验结果表明，RA分离菌株对头孢类(头孢他啶、头孢噻肟、头孢噻呋)、阿莫西林、氨苄西林敏感，与雍燕等[9]研究结果一致；对青毒素G、环丙沙星、氧氟沙星、强力霉素、卡那霉素、阿米卡星、磺胺异恶唑、链霉素耐药，与骆延波等[10]研究结果一致。建议该场选用敏感药物头孢类、阿莫西林、氨苄西林进行防治。