戊糖乳杆菌LS1细菌素的分离纯化及性质鉴定

李志如，韩建春,,，刘容旭，刘丹怡，梁君锋

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江 哈尔滨 150030；2.黑龙江省绿色食品科学研究院，黑龙江 哈尔滨 150028）

细菌素是一种小分子质量生物活性抗菌肽，在许多细菌的核糖体中合成并在细胞外释放。细菌素能够杀死或抑制原核生物的生长，有助于抵抗病原体和一些具有抗生素抗性的细菌菌株[1]。细菌素与合成药物和化学防腐剂不同，即使在低剂量下，细菌素仍然具有快速和强效的作用[2]，并且不会显著改变人体肠道的微生物群[3-4]。其新的作用模式和对一些致病性细菌具有抑制作用，使其在食品防腐和保鲜方面备受关注[5-6]。其中乳酸菌细菌素通常被认为是安全的[7]，目前产细菌素戊糖乳杆菌已有许多文献报道[8-10]。其中Okkers[11]对Pentocin TV35b进行纯化；吕燕妮[12]对Pentocin 31-1分离纯化。戊糖乳杆菌素多具耐热性高、分子质量小、在酸性或弱碱性条件下稳定的特点[13]，具有广泛的抑菌谱并且对一些食品致病菌具有较强的抑制作用[14]，对于食品和制药工业都具有重要意义。

本研究主要对从酸菜水中得到的乳酸菌进行16S rDNA鉴定并测定其生长曲线，然后从其发酵液中分离纯化细菌素，测定其分子质量。同时研究温度、pH值、酶和化学试剂对该细菌素抑菌效果的影响。目的是研究细菌素的有效分离和纯化方法以及生物学特性，为其进一步研究及应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus）LS1分离自酸菜水；指示菌单核细胞性李斯特菌（Listeria monocytogenes）CMCC54004和大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922均保藏于东北农业大学食品学院教育部乳品科学重点实验室。

乳酸链球菌素标准品、H2O2酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K 美国Sigma公司；醋酸钠、冰乙酸等均为国产分析纯；乙腈、三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）和甲醇均为色谱纯。

1.2 仪器与设备

SP Sepharose Fast Flow填料、Superdex 30 Increase层析柱、GE AKTA pure 150蛋白纯化液相色谱系统 瑞典GE Healthcare公司；3-30KS高速冷冻离心机 德国Sigma公司；Pilot5-8ES真空冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；Ultimate3000高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）仪 德国Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 戊糖乳杆菌LS1生长与拮抗活性曲线

将活化后的戊糖乳杆菌LS1接种到MRS液体培养基中，并培养至对数生长期（108CFU/mL）。接种3%种子液于250 mL MRS培养基，每2 h（0～48 h）取发酵液5 mL。稀释后，用MRS培养基作空白对照，测定OD600nm值；每6 h（0～48 h）取发酵液5 mL测定pH值，8 000 r/min离心15 min取上清液，通过琼脂扩散牛津杯法测定抑菌活性，以单核细胞性李斯特菌CMCC 54004为指示菌。

1.3.2 产细菌素菌株鉴定

采用16S rDNA鉴定，参照Jang等[15]方法，离心收集菌体后，用DNA提取试剂盒，提取出菌株DNA，引物为27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3’），送于吉林省库美生物科技有限公司测序。

1.3.3 发酵上清液制备

将5%的戊糖乳杆菌LS1（18 h细胞年龄）培养物接种到MRS肉汤上，37 ℃培养42 h，8 000 r/min离心15 min后，通过0.22 μm膜过滤得到上清液与菌体，取上清液用3.0 mol/L NaOH溶液将pH值调至6.5，冻干备用。

1.3.4 细菌素分离纯化

1.3.4.1 硫酸铵粗提细菌素

取15 g冻干样品溶于1 000 mL去离子水，用20%、40%、60%、80%饱和度的硫酸铵，在转速120 r/min条件下搅拌24 h，然后10 000 r/min、4 ℃离心20 min，通过0.22 μm孔径的硝酸纤维素膜过滤分别得到上清液与沉淀，以单核细胞性李斯特菌CMCC54004和大肠杆菌ATCC25922为指示菌，采用琼脂扩散牛津杯法分别测定沉淀复溶液与上清液的抑菌圈直径，并以没有接菌的培养基经硫酸铵沉淀后的沉淀复溶液作空白对照，选取硫酸铵溶液的最佳饱和度。

1.3.4.2 Sephadex G-10柱色谱脱盐及纯化

将60%饱和度硫酸铵进行沉淀，离心过滤后的上清液通过Sephadex G-10柱色谱系统脱盐并纯化，以超纯水为缓冲液，流速为6 mL/min，然后通过280 nm波长检测细菌素，采用琼脂扩散牛津杯法测定其抑菌活性。

1.3.4.3 SP Sepharose Fast Flow纯化

参照Tahiri等[16]方法并稍作修改，将从Sephadex G-10柱色谱系统纯化获得初步纯化细菌素通过20 mmol/L醋酸盐冲液（pH 3.8）平衡的SP-Sepherose Fast Flow进行纯化。用NaCl梯度（0～0.5 mol/L）线性洗脱细菌素，流速为5 mL/min。然后通过280 nm波长紫外检测细菌素，并测定其抑菌活性。然后合并活性级分，用Sephadex G-10柱色谱系统脱盐后，真空冷冻干燥。

1.3.4.4 Superdex 30 Increase分离纯化细菌素

参照刘辉[17]方法并稍作修改，用5 mL醋酸盐缓冲液溶解冻干样品，使用Superdex 30 Increase，平衡2 个柱体积，在pH 5.2条件下洗脱，洗脱体积为1.5 CV，通过紫外280 nm波长处检测细菌素，流速1 mL/min，每6 mL为一管进行收集，通过琼脂扩散牛津杯法测定其抑菌活性。

1.3.5 细菌素纯度的检测

参照Ullah等[18]并稍作修改，取纯化后获得的活性峰样品，使用HPLC测其纯度。平衡液A：超纯水＋0.1% TFA；洗脱液B：纯乙腈＋0.1% TFA；上样量为20 μL，以1.0 mL/min的流速，洗脱程序为0～5 min，95% A，5% B；5～20 min，95%～0% A，5%～100% B。采用Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），在215 nm波长处进行紫外检测。

1.3.6 质谱分析

参照刘辉[17]方法并稍作修改，采用液相色谱-串联质谱法测定从Superdex 30 Increase分离纯化得到的细菌素Pentocin LS1分子质量。上样为20 μL，洗脱条件为5%～90%乙腈溶液，洗脱时间60 min，总离子流图m/z340～2 000，通过数据依赖采集模式收集数据。二级质谱是采用诱导碰撞解离（collision-induced dissociation，CID）方式捕捉二级质谱中的b和y离子，通过Peaks 7.0软件进行数据采集和分析[19]。

1.3.7 抑菌谱

将所有指示菌在37 ℃培养24 h后，稀释至106CFU/mL，制备涂布有不同细菌的指示平板。在不同指示平板上通过牛津杯扩散法检测发酵上清液样品对不同指示菌是否产生抑菌圈，并测量抑菌圈直径。

1.3.8 细菌素稳定性分析

按照Ge Jingping等[20]方法进行细菌素稳定性实验。将细菌素置于40、60、80 ℃持续30 min以及100、121 ℃持续15 min，在将样品冷却至室温后测试抑制活性。通过添加不同的酶测试细菌素对酶的敏感性，即蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明质酸酶、过氧化氢酶，使最终酶质量浓度为1 mg/mL，然后在37 ℃将该溶液温育1 h后，测试抑制活性。将细菌素调节至各种pH值（2、3、5、8和10），然后在室温下温育2 h，测试抑制活性。接触不同化学品时细菌素的稳定性，即1%（V/V）吐温80、1%（V/V）Triton X-100、1 mg/mL十二烷基硫酸钠，通过将这些化学物质添加到细菌素中然后在室温下孵育2 h然后测定抑制活性。

1.4 数据分析

2 结果与分析

2.1 戊糖乳杆菌LS1生长与拮抗活性曲线

图1 LS1菌株的生长及拮抗活性曲线Fig.1 Growth rate and antagonistic activity curves of strain LS1

将戊糖乳杆菌LS1在37 ℃条件下培养，其生长曲线见图1。在培养2 h后进入对数生长期，菌体数量迅速增加，在22 h达到峰值，然后逐渐平缓，到达稳定期；pH值从第6小时开始快速下降，24 h后逐渐稳定至3.7左右；培养18 h后出现明显抑菌圈，在第42小时抑菌直径达到峰值为20.51 mm，随后趋于平缓，说明抑菌活性物质主要在发酵后期产生。

2.2 乳酸菌菌种的鉴定

以2%琼脂糖凝胶对提取菌株DNA后扩增片段进行电泳，得到约1 500 bp的聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）片段，结果见图2。

图2 LS1菌株的16S rDNA PCR产物琼脂糖电泳图Fig.2 Agarose gel electrophoresis patterns of PCR-amplified fragments from LS1 strain

将PCR的产物在吉林省库美生物科技有限公司测序，将测序的结果输入到www.NCBI.nlm.nih.gov，进行BLAST比对分析，得到菌株的相似度。根据同源性分析发现LS1属于戊糖乳杆菌，相似度达到99%，采用MEGA 7.0软件，邻接算法构建出系统发育树，结果见图3。

图3 LS1菌株的16S rDNA基因序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree of strain LS1 based on the 16S rDNA gene sequence

2.3 细菌素的分离纯化

2.3.1 硫酸铵粗提细菌素

由表1可知，分别用饱和度为20%、40%、60%硫酸铵，得到的沉淀量随硫酸铵饱和度增加而增加，但均没有明显抑菌圈，上清液中出现较大抑菌圈并且差异不显著；在硫酸铵饱和度为60%时，对大肠杆菌抑菌直径为17.60 mm，对单核细胞性李斯特抑菌直径为20.15 mm。当硫酸铵饱和度增加到80%时，沉淀中出现抑菌圈，相应地在上清液中抑菌圈减小。说明在硫酸铵饱和度达到80%以后发酵上清液中的细菌素就会被逐渐沉淀出来。故选择60%硫酸铵既能够保证将细菌素留在上清液中又能够最大程度地将杂蛋白沉淀除去。

表1 不同饱和度的硫酸铵沉淀细菌素结果Table 1 Results of bacteriocin precipitation using different degrees of ammonium sulfate saturation

2.3.2 Sephadex G-10柱色谱脱盐并纯化

图4 Pentocin LS1的Sephadex G-10层析图谱Fig.4 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on Sephadex G-10

由于60%硫酸铵沉淀除杂上清液中含有大量盐，选用Sephadex G-10柱色谱进行脱盐。得到P1、P2两个较大的紫外峰（图4），P2无明显抑菌圈而且与盐峰重合；P1峰形较好，能够较好地与分子质量较小杂蛋白分开，对大肠杆菌和单核细胞性李斯特菌抑菌活性分别为25.62 mm和17.88 mm；故选择峰P1进行下一步纯化。

2.3.3 SP Sepharose Fast Flow纯化抗菌肽

图5 Pentocin LS1的SP Sepharose Fast Flow层析图谱Fig.5 Ion-exchange chromatogram of pentocin LS1 on SP Sepharose Fast Flow

研究表明，大部分由乳酸菌产生的细菌素含有碱性氨基酸，在酸性及中性的条件下带正电荷，能够被阳离子层析柱吸附。将Sephadex G-10柱色谱脱盐并纯化得到的细菌素粗品在pH 3.8的条件下进行SP Sepherose Fast Flow分离纯化[17,21]，如图5所示，将收集液通过牛津杯法测定抑菌活性，结果表明抑菌活性区域在主要分离峰后面（图5阴影部分），说明Pentocin LS1对阳离子柱SP Sepharose Fast Flow的吸附能力较其他杂蛋白强，洗脱下来活性位置在主洗脱峰后面，说明大部分杂蛋白已经除去，有利于后期的分离纯化。经过SP Spharose Fast Flow离子层析柱，可以从上清液中分离出大部分有活性的细菌素，细菌素的比活力是原发酵上清液的28.4 倍。

2.3.4 Superdex 30 Increase分离纯化细菌素

图6 Superdex 30 Increase分离纯化Pentocin LS1的色谱图Fig.6 Chromatogram obtained from purification of pentocin LS1 by Superdex 30 Increase

由电泳所得bacteriocin-LS1估测分子质量，采用Superdex 30 Increase作为最后一步纯化，分离过程如图6所示。可以看出活性主要集中在463～469 mL。采用牛津杯的方法，对分离纯化各个步骤进行取样测定活性，结果如表2和图7所示，Pentocin LS1比活力逐渐增大，Superdex 30 Increase虽然得率低，只有2.1 mg，但其获得了110.5 倍纯化，Pentocin LS1比活力达到了1 238.1 AU/mg，说明在分离小分子物质中凝胶层析能够起到更明显的分离作用。

表2 细菌素LS1的分离纯化Table 2 Summary of purification steps of pentocin LS1

图7 分离纯化后细菌素的抑菌结果Fig.7 Antibacterial effect of pentocin LS1 after separation and purification

2.4 HPLC检测细菌素纯度

图8 Pentocin LS1的HPLC图谱Fig.8 Analytical RP-HPLC profile of pentocin LS1

HPLC具有高分辨率的特征，能够检测出细菌素的纯度[18,22-23]。利用样品的极性和疏水性进行分离，经过Superdex 30 Increase纯化后的样品经过HPLC分析（图8），在6.7 min处出峰，峰形较好，没有出现明显杂峰，说明得到了较高纯度的Pentocin LS1。

2.5 质谱分析

经过Superdex 30 Increase分离纯化后的细菌素样品进行液相色谱-串联质谱分析，得出Pentocin LS1的分子质量为1 123.8 Da。对1 123.8 Da的峰再次进行液相色谱-串联质谱分析，得到二级质谱图（图9）。通过Peaks 7.0软件对该细菌素的二级质谱片段进行分析得出该细菌素的氨基酸序列为ACDFCFCGMK。将Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot数据库中利用BLASTP搜索相同序列，结果显示Pentocin LS1没有相同的匹配的序列，表明Pentocin LS1是一种新型的戊糖乳杆菌素。

图9 细菌素Pentocin LS1的二级质谱图Fig.9 Mass spectrum of pentocin LS1

2.6 Pentocin LS1的抑菌谱

具有广泛抗菌活性的细菌素在食品工业中具有应用价值。Pentocin LS1具有广泛的抗微生物谱（表3）。它能够强烈抑制一些革兰氏阳性细菌，如单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；同时它能抑制革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞杆菌。此外，它对乳酸菌属的一些菌株也有一定的抑制作用；然而，它不能抑制酵母和霉菌。

表3 Bacteriocin-LS1抑菌谱Table 3Antimicrobial spectrum of bacteriocin-LS1

2.7 Pentocin LS1对温度、pH值、化学试剂、蛋白酶敏感性

表4 Pentocin LS1对温度、pH值、化学试剂、蛋白酶的敏感性Table 4 Effects of heating temperature, pH, chemical reagents, and enzymes on antibacterial activity of pentocin LS1

如表4所示，在所研究温度下均保持活性，Pentocin LS1能够在巴氏杀菌下更稳定，100 ℃加热15 min仍保留80.2%的抑菌活性，但在121 ℃高压灭菌15 min后活性损失较大；在接触各种化学品后，Pentocin LS1也保持了几乎100%的活性。用蛋白酶K、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶处理导致完全丧失活性；用脂肪酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、透明质酸酶、过氧化氢酶进行酶处理后几乎无活性损失，从而证实了其蛋白质性质。细菌素Pentocin LS1的抑菌活性在pH 2.0～8.0时保持相对稳定，但其活性在pH 10.0～12.0显著降低，这种对酸的抗性可能适合于食品的制造和保存。

3 讨 论

目前许多研究已经采用不同的方法纯化由乳酸菌产生的细菌素[24-26]。本研究第1步采用硫酸铵法获得6.0 倍纯化，具有工作条件温和、成本效益高、结果快速生成、最终产品回收率高的优点。Rumjuankiat等[27]使用硫酸铵沉淀作为提取细菌素的第一纯化步骤，仅获得1.5 倍的纯化；然后采用Sephadex G-10柱色谱进行纯化，在脱盐的同时达到了分离纯化的目的，较目前常用的透析袋脱盐有着脱盐效果好、快速等特点；而最后一步精细纯化采用Superdex 30 Increase得到了纯度较高的细菌素，刘辉[17]在最后一步精细纯化也用该方法获得了高纯度细菌素。

通过质谱法测得戊糖乳杆菌素Pentocin LS1分子质量为1 123.8 Da。关于从戊糖乳杆菌中纯化细菌素并获得准确分子质量的报道较少，其中有Pentocin MQ1[28]（2 110.672 Da）、Pentocin TV35b[11]（3 929.63 Da）、Pentocin 31-1[29]（5 592.225 Da）、Pentocin K2N7[30]（2.017 kDa）和Pentocin JL-1[31]（2 987.23 Da）。戊糖乳杆菌素Pentocin LS1分子质量与任何已报道的戊糖乳杆菌素均不匹配，同时将Pentocin LS1氨基酸序列在GenBank和Swiss-Prot数据库中利用BLASTP搜索相同序列，结果显示Pentocin LS1没有相同的匹配的序列，表明Pentocin LS1是一种新型的戊糖乳杆菌素。

Pentocin LS1具有广泛的抑菌活性，对一些革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌表现出较强的抑制活性。Zhang Jinlan等[29]也报道了Pentocin 31-1是一种广谱细菌素，对单核细胞性李斯特菌，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抑制活性。Watthanasakphuban等[30]报道Pentocin K2N7具有较窄的抑菌活性，对单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌均没有抑制作用，但对乳酸菌属的一些菌株显示出抑制作用。Wayah等[28]研究得出Pentocin MQ1是一种广谱细菌素，对单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和铜绿假单胞杆菌具有抑制活性，并且能够抑制植物乳杆菌K25。Pentocin LS1能够强烈抑制一些革兰氏阳性细菌，如单核细胞性李斯特菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌；同时它能抑制革兰氏阴性细菌，包括大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞杆菌。此外，它对乳酸菌属的一些菌株也有一定的抑制作用；然而，它与大多数细菌素一样都不能抑制酵母和霉菌。广泛的抗菌活性是选择细菌素用于食品保存的重要标准之一[32-33]，Pentocin LS1的广泛抗菌谱很好地表明它是食品防腐剂的良好候选者。Pentocin LS1对所研究的化学处理均高度稳定，同时具有很高的热稳定性和pH值稳定性，在pH 2.0～10.0和40～121 ℃仍具有活性。已报道的Pentocin TV35b在pH 1.0～10.0和60～100 ℃温度处理后具有活性[11]；Pentocin 31-1与Pentocin LS1具有相似的稳定性都在pH 2.0～10.0和60～121 ℃时具有活性[29]；Pentocin MQ1在40～120 ℃有抑菌活性，在pH 10时无活性，但用化学试剂处理后仍具有稳定性[28]；Pentocin K2N7在pH 2.0～12.0时保持活性，但在121 ℃时无活性[30]。Pentocin LS1对化学，pH值和热稳定的属性有利于其在食品加工中的应用[34]，同时其本质为多肽，具有对蛋白酶敏感的的特性，降低其对有益肠道菌群的抑制，从而提高了其安全性[35]。

4 结 论

利用16S rDNA基因序列对从酸菜水中分离出的1 株产细菌素菌株LS1进行鉴定，最终鉴定该菌为戊糖乳杆菌。细菌素依次通过硫酸铵沉淀取上清液经Sephadex G-10柱色谱脱盐并纯化，然后SP Sepharose Fast Flow中度纯化，最后Superdex 30 Increase精细纯化。纯化后比活力1 238.1 AU/mg，是原始活性的110.5 倍。根据液相色谱-串联质谱测定细菌素分子质量为1 123.8 Da，氨基酸序列为ACDFCFCGMK。细菌素Pentocin LS1对温度、pH值、化学试剂都有很好的稳定性，且能够被肠道中的酶灭活，同时对一些食品致病菌有着较强的抑制作用，在食品防腐和保鲜方面有着重要意义。