溶解曲线法与培养法检测结核分枝杆菌异烟肼、利福平耐药的临床价值分析

河南省信阳市第五人民医院（464000）张宁 王海燕 何小帆

我国属于耐多药结核病发病率的首位国家，目前治疗此疾病的一线药物则为利福平、异烟肼两种，且也为诊断耐多药结核病的依据，检测其耐药性对临床及时诊治耐多药结核病有重要作用。以往多采用培养法进行检测，此方式操作复杂、检测时间长。随着医学界检测技术发展，分子生物学诊断方式逐步在临床得到应用，溶解曲线法则为近年来不少学者主张的首选检测其耐药性的方式之一[1]。现纳入116例结核病患者讨论此点。

1 资料及方法

1.1 一般资料 随机从我院2018年3月～2019年3月期间收治的结核病患者中抽取116例，116例中包含男性60例，女性56例，年龄21～67岁，平均为（35.8±1.2）岁，结核病病程时间0.3月～4个月，平均为（1.4±0.3）个月。患者均满足《WHO耐药结核病治疗指南(2016更新版)》[2]中结核病诊治标准，均自愿接受此次检测。收集患者脓液、灌洗液、脑脊液、胸腔积液、痰液等进行培养后，显示为结核分枝杆菌阳性，再用培养法和溶解曲线法检测利福平和异烟肼耐药性检测。

1.2 方法 此次检测金标准为传统培养法，计算符合率、特异度、灵敏度等，进而评估溶解曲线法测定利福平、异烟肼的作用。

检测方法：培养法采用WHO/IUATLD组织制定的比例阀，基础培养基和对照均为无淀粉改良罗氏培养基，检测利福平、异烟肼药物敏感性。异烟肼药物终浓度为0.2ug/ml，利福平药物终浓度为40ug/ml。取菌液10-4mg/ml和10-2mg/ml，将其接种到含药培养基和对照表面，再将其放在恒温培养箱内（温度36℃）进行培养。1个月后出结果。若试验管菌落数/对照管菌落数结果高于1%，则可判定为耐药。

检测耐药突变：结核分枝杆菌复合群菌种为标本，用PCR溶解曲线法检测，整个过程按试剂说明书进行操作，提取NDA后，做扩增处理，并确定阳性、阴性对照。

仪器设备自动评估读出Tm值，比较阳性对照和检测标本两者间Tm值，进而评估有无突变。野生型：若阳性对照熔点与4通道内样品点相符，菌株对利福平或异烟肼敏感；突变型：阳性对照高于任意通道内熔点2℃或以上，菌株对利福平或异烟肼耐药。

1.3 指标判定 本研究各检测均需由医院检验科2名专业且工作经验丰富者负责，全程无需他们协助，若发生意见分歧，可查阅相应资料和文献，共同商讨得出结果，以确保检测的客观性、准确性。

1.4 统计学方法 用统计学软件（SPSS13.0版本）分析数据，X2检验检测结果（%），用符合率、特异度、灵敏度评估溶解曲线法检测作用，若P<0.05，则有统计学意义。

2 结果

2.1 异烟肼耐药结果 溶解曲线法显示34株耐药，82株敏感；培养法显示29株耐药，77例敏感，两种方式检测结果差异小（P>0.05），金标准为培养法，溶解曲线法检测特异度为96.43%（81/84），敏感度为96.88%（31/32），符合率为99.14%（115/116），1株不符。见附表1。

附表1 比较异烟肼耐药结果

2.2 利福平耐药结果 溶解曲线法显示24株耐药，92株敏感；培养法显示19株耐药，97例敏感，两种方式检测结果差异小（P>0.05），金标准为培养法，溶解曲线法检测特异度为94.85%（92/97），敏感度为100.00%（19/19），符合率为95.69%（111/116），5株不符。见附表2。

附表2 比较利福平耐药结果

3 讨论

近年受多种因素影响，结核分枝杆菌耐药有所攀升。降低耐药结核病持续传染的主要措施则为及时诊治。异烟肼、利福平两类药物为治疗结核病的一线且常用药物[3]，是否敏感对治疗疗效有直接影响，此则涉及到检测其耐药性。以往采用的培养法，已发展为检测结核分枝杆菌耐药的金标准，但也因其检测时间长，逐步无法满足疾病诊治需求，且对检测条件要求高，操作复杂[4]，无法在基层医院实施，此对持续推广培养法测定结核分枝杆菌耐药有较大局限性。结核分枝杆菌缓慢生长的特征对临床及时诊治疾病存在限制，因此，探寻一种简便、快速、敏感、特异的结核病耐药诊断方式为目前控制结核病传染和提升治疗效果的主要任务。

随着医学界各项技术改进，溶解曲线法逐步进入人们视线，且已在临床得到认可。将其用于检测结核耐药菌种，具有低污染、可重复、敏感性高、检测速度快等优势[5]，但也存在操作复杂、成本高、设备条件需求高等缺陷，也暂未得到广泛推广。我院引进基础为溶解曲线法的检测结核耐药突变的试剂盒，检测成本得到明显降低，且仪器可自行显示结果，操作简单，现已在临床得到认可。本研究中共讨论结核分枝杆菌分离株116株，结果显示，培养法和溶解曲线法两者在对利福平和异烟肼耐药性检测的特异度和灵敏度方面一致性较好，提示溶解曲线法在测定结核患者利福平、异烟肼药物耐药上也具有较大优势。但溶解曲线法在检测过程中，无法筛选氨基酸序列，仅对核酸序列有用[6][7]，所以，可能会将不导致氨基酸变化的突变判定成突变。此外，此方式无法从方法上区分突变具体位点，所以结果显示为突变，无法绝对的将其判定为耐药[8]。溶解曲线法属于检测结核病药物耐药的新型方式，其结果与金标准培养法一致性高，可节省检测时间，3h则可完成检测，此为诊治结核疾病赢得了时间，也对控制疾病传染有较大意义。

综上，检测结核病患者利福平、异烟肼药物耐药状况，可采用溶解曲线法，此方式检测敏感度、特异度、符合率均较高，临床应用价值大。