响应面法优化Fenton氧化预处理杨木的研究

雷珊珊 石 艳 支亚美 尹 浩 姚 兰

（湖北工业大学材料与化学工程学院，湖北武汉，430068）

纤维素乙醇，即第二代生物质乙醇，是指由富含纤维素的植物纤维原料经预处理、纤维素酶解及酵母发酵等过程制备得到的液体燃料。其中，预处理是必不可少的重要步骤，主要作用为破除木质纤维原料的酶解障碍，增加纤维素在酶解过程中的可及度以提高葡萄糖得率［1］。预处理方法包括物理法、化学法和生物法。其中，化学法是最有可能实现工业化生产的一种预处理方法，主要包括酸预处理、碱预处理和有机溶剂预处理［1］。Fenton反应由于产生具有高氧化强度的羟基自由基（·OH），可以模拟木质纤维素的生物降解［2-4］，具有低能耗、抑制物产生少等优点，是目前最有前途的预处理技术之一［5-7］。H2O2是一种氧化性很强的氧化剂，在低浓度下其反应速率很慢，但加入铁盐后会显著增加其氧化性，在酸性条件下可产生羟基自由基（Fe2++H2O2=Fe3++·OH+OH-）［8］。目前，Fenton氧化预处理已经应用于处理稻草，并获得了93.2%的酶解糖化产率［9］。Fenton氧化与NaOH萃取结合预处理甘蔗渣，在同步糖化发酵条件下酶解率为64.7%，乙醇浓度可达17.44 g/L［10］。研究表明，铁盐的种类和浓度、pH值及H2O2的加入量都会影响Fenton氧化预处理的效果［5-6］。最近的一项研究在对FeSO4·7H2O、FeCl2·4H2O、Fe2（SO4）3和FeCl3·6H2O进行比较后发现，FeCl3·6H2O是Fenton氧化预处理稻秆最有效的铁盐［6］。当使用三价铁盐参与Fenton反应时，首先发生的反应是Fe3++H2O2=Fe2++·OOH+H+，然后生成Fe2+再与H2O2反应生成·OH。且鉴于二价铁盐在实际应用中往往不稳定；因此，本研究采用三价铁盐进行Fenton氧化预处理。

响应面法是优化多个交叉因子获得最大产值的一种数学模型类优化工具［11］，可以从实验数据中解决多元方程的问题，并且可以同时计算和评估这些因子从而得出最佳设计方案［12］，在预处理植物纤维原料制备生物质乙醇的高值化利用研究中已有诸多应用［13-15］。本研究以杨木为原材料，以Fenton氧化预处理得率和葡萄糖得率作为考察指标，探讨H2O2/FeCl3（体积比，下同）、pH值及FeCl3浓度对Fenton氧化预处理杨木的影响。在单因素实验基础上，利用中心组合-响应面法优化了Fenton氧化预处理杨木的工艺条件，以期为生物质材料制备生物质乙醇提供基础数据。

1 实验

1.1实验原料

杨木，取自湖北某农场，经植物粉碎机（FZ102，天津市泰斯特仪器有限公司）粉碎后取40～60目组分，经苯-醇（2∶1，体积比）抽提脱除脂溶物后待用。

1.2实验方法

1.2.1Fenton氧化预处理

取上述制备的杨木粉10 g加入到500 mL三角瓶中，按固液比为1∶20（m/V）配置预处理液并摇匀，在40℃保温反应24 h后，进行固液分离并清洗预处理后的固料至中性，将固料放于4℃冰箱内保存备用，根据式（1）计算Fenton氧化预处理得率。

式中，Y为Fenton氧化预处理得率，%；m1为预处理后固料的质量，g；s1为预处理后固料的含水率，%；10为杨木粉的取样质量，g；s2为杨木粉的含水率，%。

1.2.1.1单因素实验

本研究主要考察H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3浓度对Fenton氧化预处理得率及葡萄糖得率的影响。单因素实验中，H2O2/FeCl3分别为5%、10%、25%和75%，pH值分别为1.5、2.0、2.5和3.0，FeCl3浓度分别为10、25、50和75 mmol/L。

1.2.1.2中心组合-响应面实验设计

通过单因素实验找出以H2O2/FeCl3、pH值和FeCl3浓度为自变量的中心点。然后以-1、0、1分别说明3个自变量的低、中、高水平进行实验，计算分析每一预处理条件的得率和葡萄糖得率。以H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3浓度三选二为自变量，以预处理得率和葡萄糖得率为因变量作图，得到最佳处理条件。设计三因素三水平实验，具体见表1。

表1 中心组合-响应面实验因素及水平

1.2.2Fenton氧化预处理杨木的纤维素酶解

称取0.50 g绝干Fenton氧化预处理后杨木置于50 mL洁净三角瓶内，纤维素酶加入量为25 FPU/g。使用pH值为4.8的醋酸-醋酸钠缓冲溶液（CH3COOHCH3COONa，0.2 mol/L）配置纤维素酶溶液，并加入1 g/L叠氮钠抑制微生物的生长。将三角瓶移入ZHWY-2112B摇床中（上海市智诚分析仪器有限公司），反应温度为50℃，转速为150 r/min，反应72 h后取一定量的酶解液，在8000 r/min条件下离心5 min，上清液用于葡萄糖得率分析。

1.3分析方法

1.3.1葡萄糖得率的测定

采用高效液相仪（日本岛津）测定葡萄糖含量，具体测定条件为：Aminex HPX-87P色谱柱（美国Bio-Rad），柱温65℃，流动相为超纯水，流速为0.6 mL/min，示差检测器，根据浓度和峰面积绘制葡萄糖（色谱纯）标准曲线。根据测出的葡萄糖质量计算葡萄糖得率，见式（2）。

式中，C为葡萄糖得率，%；0.50为Fenton氧化预处理后的杨木取样绝干质量，g；m3为Fenton氧化预处理杨木酶解得到的葡萄糖质量，g。

1.3.2成分分析

木质纤维原料的成分分析测定按照文献［16］描述的方法进行。本研究所用杨木的成分分析结果如表2所示。

表2 杨木成分分析 %

1.3.3X射线衍射（XRD）分析

采用XRD（荷兰帕纳科锐影）检测Fenton氧化预处理前后杨木的结晶度，扫描范围为2θ=10°～50°。

1.3.4比表面积分析

采用ASAP2020物理吸附仪（美国麦克瑞默尔公司），根据气体吸附BET法测定样品的比表面积，测定条件为：脱气温度50℃，脱气时间8 h。具体步骤参见GB/T 19587—2004。

1.3.5扫描电子显微镜（SEM）分析

采用SU8010 SEM（日本日立）观察Fenton氧化预处理前后杨木的微观形态，测试前对样品进行镀金处理。

2 结果与讨论

2.1单因素实验

研究H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3浓度对Fenton氧化预处理杨木葡萄糖得率的影响，结果如图1所示。由图1可知，随着预处理液中H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3浓度的增大，葡萄糖得率都呈先上升后下降的趋势，这一结果与前期其他研究者得到的结果一致。结果表明，当Fe3+浓度达到一定值后，继续增加Fe3+的浓度会抑制纤维素酶的活性［10］；此外，高于或低于最佳pH值也会影响Fenton氧化反应［17］。综上，H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3浓度的最佳值分别为10%、2.5和50 mmol/L。

图1 H2O2/FeCl3、pH值及FeCl3浓度对Fenton氧化预处理杨木葡萄糖得率的影响

2.2中心组合实验

为了验证单因素实验得出的Fenton氧化预处理杨木的最佳条件（H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，FeCl3浓度50 mmol/L），设计中心组合实验对这一条件进行进一步优化。将最佳条件作为中心点条件代入表1中得到所有的预处理条件，具体条件及结果见表3。

表3 Fenton氧化预处理杨木中心组合实验条件及结果

从表3可以看出，杨木经Fenton氧化预处理后得率相差不大，基本都在80%～95%，表明与其他方法相比，Fenton氧化预处理可以获得更高的预处理得率［1，18］。H2O2作为一种强氧化剂，可以氧化脱除木质纤维原料中的组分；由表3可知，当H2O2/FeCl3为5%时，其预处理得率较H2O2/FeCl3为10%和15%时高，说明在Fenton氧化反应中，过量的H2O2会导致纤维素纤维的降解［8］，反而使预处理得率降低。在酸性条件下，Fenton氧化预处理可产生高度活性的·OH，因此pH值对Fenton氧化预处理也有较大影响。对比11#、12#和15#3组预处理条件可以发现，在其他条件相同时，改变Fenton氧化预处理的pH值对预处理得率的影响不大，但总的趋势是随着pH值的提高，预处理得率下降。葡萄糖得率受pH值影响较大，当pH值为2.0和3.0时，Fenton氧化预处理杨木葡萄糖得率仅为约20%，而pH值为2.5时，葡萄糖得率可增至50%以上，说明在这一pH值条件下，体系中参与Fenton氧化的Fe3+浓度达到了最大值［19］。以上结果说明，以预处理得率和葡萄糖得率为依据，Fenton氧化预处理杨木的最佳条件为H2O2/FeCl3=10%，pH值2.5，FeCl3浓度50 mmol/L。

2.3响应面分析

2.3.1响应面法分析Fenton氧化预处理条件对葡萄糖得率的影响

根据表3中的数据，运用软件STATISTICA10.0绘制Fenton氧化预处理条件与葡萄糖得率之间的关系图，结果如图2所示。

图2 Fenton氧化预处理条件对葡萄糖得率影响的响应面图

从图2可以看出，随着H2O2/FeCl3、pH值、FeCl3浓度的逐渐增大，葡萄糖得率呈先增大后下降的趋势，在响应面的中心点出现一个最大值，即在中心点处葡萄糖得率最大。在中心点条件下，Fenton氧化预处理杨木葡萄糖得率可达51.4%。这一葡萄糖得率是基于初始原料质量计算得到的，如果以原料中聚葡萄糖含量为基准（理论值100%）计算，在中心点条件下，葡萄糖得率可高达理论值的94.7%，远高于其他预处理方法［1，20-23］，说明Fenton氧化预处理杨木可获得较高的葡萄糖得率。

用软件Minitab17分析Fenton氧化预处理条件对葡萄糖得率的影响可知，H2O2/FeCl3对葡萄糖得率影响的p值为0.445（p＞0.1），pH值对葡糖得率影响的p值为0.157（p＞0.1），这两者p值均大于0.1，说明H2O2/FeCl3和pH值对葡萄糖得率无显著性影响。而FeCl3浓度对葡萄糖得率影响的p值为0.035（p＜0.05），由此可知，Fenton氧化预处理杨木时，FeCl3浓度对葡萄糖得率的影响最显著。

2.3.2Fenton氧化预处理条件对脱木质素的影响

研究表明，木质素的脱除可以显著增加木质纤维原料的酶解得率，因为木质素会在酶解过程中对纤维素酶造成无效吸附而降低有效酶活［24-25］。有研究表明，Fenton氧化预处理可改变木质纤维原料中木质素的结构性质而增加其酶解效率［7］，因此本研究测定了不同预处理条件对杨木脱木质素的影响，结果见表4。

表4 不同预处理条件对杨木脱木质素的影响

从表4可以看出，经Fenton氧化预处理过后，杨木中的木质素有不同程度的脱除。2#预处理条件下木质素脱除率最高，为35.6%；而1#预处理条件下，杨木木质素脱除率不到1%。在最佳预处理条件（15#）下，木质素脱除率为26.1%。虽然前期的研究［26］表明，木质素的脱除有利于纤维素酶解效率的提高，但在本实验结果中，并未发现木质素脱除率与葡萄糖得率的直接相关性，说明Fenton氧化预处理提高木质纤维原料的酶解效率不仅在于木质素的脱除，可能还包括原料其他性质的变化，如纤维素结晶度和纤维素聚合度等的改变。

用软件Minitab17分析Fenton氧化预处理条件对杨木脱木质素的影响可知，H2O2/FeCl3对杨木脱木质素影响的p值为0.012（p＜0.05），pH值对杨木脱木质素影响的p值为0.846（p＞0.1），FeCl3浓度对杨木脱木质素影响的p值为0.324（p＞0.1），由此可知，Fenton氧化预处理杨木时，H2O2/FeCl3对脱木质素影响最显著。

2.4Fenton氧化预处理对杨木性能的影响

2.4.1Fenton氧化预处理对杨木纤维素结晶度的影响

有研究结果表明，木质纤维原料的纤维素结晶度对其酶解性可能有较大的影响，因为无定形区较结晶区更容易被酶解。但其他相关研究［27-28］也表明，对于预处理后的木质纤维原料来说，纤维素结晶度对其酶解性能可能没有影响。Fenton氧化预处理前后杨木的XRD谱图如图3所示。由图3可知，杨木的XRD谱图呈典型的纤维结构特征。由计算得到，Fenton氧化预处理前杨木的纤维素结晶度为39.9%，经最佳预处理条件处理后，杨木的纤维素结晶度上升至45.0%，较预处理前提高了12.8%。预处理后木质纤维原料的纤维素结晶度提高在其他研究中也有报道［28-30］。纤维素结晶度的提高说明Fenton氧化预处理主要破坏了杨木纤维中的纤维素无定形区，脱除了部分半纤维素和木质素［6］；此外，也可能是纤维素发生氢键重排，造成重结晶现象导致的。

图3 Fenton氧化预处理前后杨木的XRD谱图

2.4.2Fenton氧化预处理对杨木比表面积的影响

本研究采用气体吸附BET法测定了Fenton氧化预处理前后杨木的比表面积。实验结果表明，杨木的比表面积由预处理前的0.91 m²/g增加到预处理后的1.63 m²/g（最佳预处理条件下），较预处理前提高了80.2%。比表面积的增加有利于纤维素酶与底物的接触，可使更多的纤维素被纤维素酶降解为葡萄糖而提高葡萄糖得率。这与其他研究［28-29］得到的结果一致，即木质纤维原料经预处理后，其比表面积的增大与其纤维素转化率的增加有正相关关系。

2.4.3Fenton氧化预处理对杨木表面形态的影响

Fenton氧化预处理前后杨木的SEM图如图4所示。从图4可以看出，未经过预处理的杨木，其表面平滑、致密有序，说明细胞壁中的纤维素、半纤维素和木质素相互交织在一起。Fenton氧化预处理后的杨木表面变得比较粗糙，有裂痕以及孔洞的存在，结构变得松散。另外，杨木的表面出现了大量的凹陷和裂痕，这在一定程度上提高了物料的比表面积，增加了纤维素酶分子与纤维素的接触位点，从而促进纤维素酶对纤维素的降解。

综上可知，经Fenton氧化预处理后，杨木的纤维素结晶度提高，比表面积增加，且结构变得粗糙松散。其中，杨木比表面积的增大和结构的改变可能增加了纤维素酶与纤维素的作用位点和可及度，促进了纤维素酶对杨木纤维的酶解程度，最终提高了葡萄糖得率。

图4 （a，c）未处理杨木和（b，d）Fenton氧化预处理杨木的SEM图

3 结论

以杨木为原料，通过单因素实验（H2O2/FeCl3（体积比，下同）、pH值和FeCl3浓度）及中心组合-响应面法优化了Fenton氧化预处理杨木的最佳条件。采用成分分析、X射线衍射（XRD）、比表面积分析及扫描电子显微镜（SEM）对预处理前后的杨木进行了表征，主要结论如下。

3.1Fenton氧化预处理杨木的最佳条件为：H2O2/Fe-Cl3=10%，pH值2.5，FeCl3浓度50 mmol/L。在最佳预处理条件下，杨木的葡萄糖得率可达51.4%，为理论值的94.7%。

3.2通过Minitab17软件分析得到FeCl3浓度对Fenton氧化预处理杨木葡萄糖得率的影响最显著，H2O2/FeCl3对脱木质素影响最显著。

3.3Fenton氧化预处理过程中脱除了部分木质素，在最佳预处理条件下，木质素脱除率达到26.1%。Fenton氧化预处理提高了杨木的纤维素结晶度（由预处理前的39.9%提高至45.0%）和比表面积（由预处理前的0.91 m²/g提高至1.63 m²/g）。杨木比表面积的增大和表面结构的改变促进了纤维素的酶降解，提高了Fenton氧化预处理杨木的葡萄糖得率。