miR-320a 在人结肠癌细胞中的生物学行为及对癌基因FOXQ1 的靶向调控机制

刘宁 陈华 吕文（通讯作者）

（深圳市人民医院急诊科 广东 深圳 518000）

结肠癌是一种常见消化道恶性肿瘤，致死率较高，且预后差、肿瘤转移复发为致死重要原因[1]。当前，临床尚未具体明确结肠癌发病机制，影响疾病早期诊治。微小RNAs（miRNAs）属于生物体内一种内源性非编码小核糖核酸，可直接靶向作用于mRNA 互补序列3'-UTR，经由对靶基因翻译进行降解、控制，发挥抑制靶基因表达作用[2]。而miR-320a 是一类经典抑癌基因，在多种肿瘤细胞中呈低表达，且与肿瘤细胞增殖、转移密切相关[3]。FOXQ1 在人体细胞代谢、凋亡、癌变等生物学行为中发挥重要作用，且与肿瘤发生密切相关，特别是在结肠癌中，受多种因子调控。本研究就该问题进行分析，探讨结肠癌肿瘤细胞中miR-320a生物学行为，并分析对癌基因FOXQ1的靶向调控机制，报道如下。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采用ATCC 细胞库提供的人HCT116 结肠癌细胞株。试剂包括福麦斯生物科技有限公司PCR 荧光定量试剂盒、美国Abcam 公司FOXQ1、武汉博士德公司McCoy's 5A 培养基、上海吉马公司人miR-320a mimics 及阴性对照小干扰RNA 等。仪器包括日本Nikon 公司倒置常规显微镜、美国Applied Biosystems 公司荧光定量PCR 仪等。

1.2 实验方法

（1）细胞株培养、传代及转染：HCT116 结肠癌细胞株以McCoy's 5A 培养基，在37℃、5% CO2细胞培养箱内培养。细胞融合80%～90%，经EDTA 胰酶消化，行常规传代培养。根据脂质体2000 试剂说明书，将人miR-320a mimics 转染miR-320a 低表达HCT116 细胞，对照组为NC 转染细胞，转染完成后6h，调整成完全培养基。

（2）miR-320a 表达检测：HCT116-mimics、HCT116-NC 组结直肠细胞总RNA 均经Trizol 法提取。根据cDNA 合成试剂盒，实施逆转录反应。采用定时荧光定量PCR 法检测miR-320a 表达，采用qPCR SuPerMix 进行实时定量PCR 反应，U6 为检测miR-320a 指标，GAPDH 为检测FOXQ1 指标。各样本中miR-320a、FOXQ1 相对表达量采用目的基因表达量=2-△△△计算，各组检测3个复孔取均值。

（3）细胞增殖、平板克隆形成实验：转染24h，在96 孔板上接种HCT116 细胞，各孔均加入溶液，置入37℃培养箱培养，共48h。细胞活力以CCK-8 法检测，各组检测3 个复孔取均值。将对数生长期HCT116 细胞制备为单细胞悬液，计数成103个细胞，在6cm2培养皿内接种2 周，甲醇固定，1g/L 结晶紫染色，计算肉眼可见克隆形成数，形成率为（克隆数/接种细胞数）×100%。

（4）细胞侵袭及荧光素酶报告基因检测：取转染后细胞，培养24h，制备成单细胞悬液，在Traswell 小室内接种，以无血清McCoy's 5A 培养基200μL 加入上室，以含10% FBS的McCoy's 5A 培养基500200μL 加入下室，置入37℃培养箱24h；结晶紫染色，显微镜下观察并计算穿膜细胞数，各组检测3 个复孔取均值。并行荧光素酶报告基因实验，采用酶标仪检测荧光强度，观察并记录数据，各组检测3 个复孔取均值。

1.3 统计学分析

2.结果

2.1 miR-320a 对HCT116 结肠癌细胞增殖的作用

转染miR-320a mimics 后HCT116 细胞数少于阴性对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表1。HCT116-mimics 组细胞活力低于HCT116-NC 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表2。

表1 miR-320a mimic 组、阴性对照组HCT116 细胞数对比（）

表1 miR-320a mimic 组、阴性对照组HCT116 细胞数对比（）

组别 例数 HCT116 细胞数miR-320a mimics 组 3 43.51±14.26阴性对照组 3 228.58±18.67 t-13.654 P-0.000

表2 HCT116-mimics 组、HCT116-NC 组细胞活力对比（）

表2 HCT116-mimics 组、HCT116-NC 组细胞活力对比（）

组别 例数 细胞活力HCT116-mimics 组 3 0.51±0.13 HCT116-NC 组 3 1.03±0.15 t-4.537 P-0.005

2.2 miR-320a 对HCT116 结肠癌细胞侵袭的作用

HCT116-mimics 组穿膜细胞数少于HCT116-NC 组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表3。

表3 HCT116-mimics 组、HCT116-NC 组穿膜细胞数对比（）

表3 HCT116-mimics 组、HCT116-NC 组穿膜细胞数对比（）

组别 例数 穿膜细胞数HCT116-mimics 组 3 0.38±0.05 HCT116-NC 组 3 1.02±0.11 t 9.174 P 0.000

2.3 HCT116 结肠癌细胞中miR-320a 与FOXQ1 间关系

miR-320a mimics 组荧光酶活性低于阴性对照组，差异有统计学意义（P ＜0.05），见表4。Western blot 实验显示，上调miR-320a可促使HCT116细胞内FOXQ1蛋白表达水平降低，见图1。

表4 miR-320a mimics 组、阴性对照组荧光酶活性对比（）

表4 miR-320a mimics 组、阴性对照组荧光酶活性对比（）

组别 例数 荧光酶活性miR-320a mimics 组 3 0.41±0.03阴性对照组 3 1.01±0.09 t-10.954 P-0.000

图1 上调miR-320a 可抑制HCT116 结肠癌细胞内FOXQ1 蛋白表达

3.讨论

结肠癌是一种常见病、多发病，全世界每年新诊断病例达60 万，国内恶性肿瘤中患病率、死亡率均居第四位[4]。而临床探索参与结肠癌细胞生长、增殖、侵袭转移的分子机制，探寻与增殖、侵袭相关新型靶基因，以指导治疗方案制定，提升患者生存率，具有重要意义。miRNA 属于18-24 核苷酸长度小片段非编码RNA，能对靶基因转录进行抑制，或促进靶基因降解。较多研究发现，结直肠癌中存在较多miRNA 异常表达，且参与调节肿瘤细胞的生物学行为[5-7]。而miR-320a 是一种新近发现的miRNA，被证实在多种癌症（含结肠癌）中存在表达下调现象，认为其可经多通路抑制结肠癌发展进程[8]。

FOXQ1 为叉头框转录因子家族成员之一，在人体多组织及器官内广泛分布，主要定位于人类染色体6P25.3，编码一种功能性氨基酸蛋白，参与人体细胞生长、代谢、凋亡或癌变等生物学过程。研究发现，FOXQ1 激活可对下游基因产生影响，在肿瘤细胞生成、增殖、侵袭及转移中发挥重要作用，且在结直肠癌、乳腺癌等较多肿瘤中存在高表达[9]。结肠癌中，FOXQ1 受多种因子调控，如TGF-β 等，但临床就结肠癌中miR-320a 是否也为FOXQ1 调控因子，尚无明确定论。而生物信息软件提示，FOXQ1 3'端非翻译区存在miR-320a 潜在结合位点。故本研究提出结肠癌中上调miR-320a 可抑制FOXQ1 表达的假设，并进行验证。调查发现，转染miR-320a mimics 后HCT116 细胞数明显较阴性对照组少，说明上调miR-320a 表达，能对结肠癌细胞增殖进行抑制。而且，HCT116-mimics 组细胞活力较HCT116-NC 组低，也提示miR-320a mimics 可抑制HCT116 细胞活力。此外，HCT116-mimics 组穿膜细胞数较HCT116-NC 组少，提示miR-320a mimics可降低HCT116 细胞侵袭能力。本研究还实施双荧光素酶报告基因实验，以验证FOXQ1 是否为miR-320a 直接靶基因，调查发现，miR-320a mimics 组荧光酶活性低于阴性对照组，而上调miR-320a 可促使HCT116 细胞内FOXQ1 蛋白表达水平降低，这说明FOXQ1为miR-320a一个直接靶标，与汤增秋等[10]结果相符。因此，笔者认为，miR-320a 对结肠癌细胞生物学功能调控中，靶向抑制FOXQ1 基因也是一个重要途径，能为结肠癌中miR-320a 作用机制提供新方向。

综上所述，结肠癌中，miR-320a可抑制肿瘤细胞增殖及侵袭，且作用机制可能与靶向抑制FOXQ1基因有关，值得进行深入研究。