基于DNA量子点复合荧光探针的沙门氏菌定量检测

王旗 程小翠 夏娟

摘 要：鼠伤寒沙门氏菌是我国最常被报道的食源性致病菌之一，已对食品安全和公众健康造成了严重的威胁。本研究将金纳米粒子和DNA量子点构建了一种新型的自组装核-壳结构荧光探针，并结合磁分离技术用于定量的检测鼠伤寒沙门氏菌DNA。聚乙烯亚胺包覆的金纳米粒子能够通过静电吸附作用结合大量的DNA量子点来放大荧光信号，并可以简化核酸适配体修饰探针的繁琐过程。复合荧光探针在5fmol L-1到5.0×103fmol L-1的范围内可以成功检测到伤寒沙门氏菌DNA，检测限为7.5fmol L-1。此外，由于金纳米粒子和DNA量子点的合成方法简单，本研究设计合成的复合探针将适用于该领域的普通技术人员。因此，这种新型探针可以方便、有效地检测沙门氏菌。

关键词：DNA量子点;金纳米粒子;羧基化磁珠;适配体;沙门氏菌

中图分类号：TN791  文献标识码：A  文章编号：1673-260X（2020）09-0076-06

近些年，伴随着层出不穷的食品安全问题，保障食品安全是当前社会共同关注的重大问题[1]。食品在加工、贮运时，极有可能会受到很多种食源性致病细菌的污染，食源性致病菌是常见的致病微生物，是指源于食品并且在人类被感染后会导致发生疾病的细菌，其种类主要包括大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等[2]。其中，沙门氏菌主要寄生在人和动物的肠道内，是一种可以使人畜共患病的病原微生物，它能够引起人类发生急性肠胃炎、伤寒、副伤寒、败血症等疾病。沙门氏菌是最常见的食源性致病菌之一，食物如果被沙门氏菌感染，造成的疾病常是大面积的爆发，致病速度十分快，对食品安全和公众健康构成严重的威胁[3]。据统计，我国每年由食源性致病菌引起的疾病而造成健康和财产损失的报告数量十分巨大，因此加强对食品中食源性致病菌的检测就显得至关重要[4]。

传统的食源性致病菌检测方法主要包括平板分离法、化学分析法、分子生物法和免疫学检测法，如我国国标（GB47989.4-2016）规定沙门氏菌检测方法为平板分离法[5]，主要为增菌、分离、生化试验和血清学鉴定等几个步骤。国标法虽然检测结果稳定性好，但该种方法十分耗时，并且检测从不同样品部位分离得到的沙门氏菌，检测的结果也不是完全一致的[6]。因此，需要开发出更加简便易操作的、稳定快速的方法来替代这些传统技术。随着科学技术的不断创新和发展，目前有着许多新型现代的检测方案可以用于完成鼠伤寒沙门氏菌的检测，例如酶联免疫吸附测定（ELISA）、聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）和表面增强拉曼散射（SERS）等[7]。然而，由于操作流程复杂、技术要求高、仪器昂贵等因素，以上这些各具优势的检测方案在普通检测机构或实验平台难以被检测人员所采用[8]。所以，设计开发出一种易于操作的细菌测试方案在实际检测工作中是迫切需要的。

据目前已有的报道称，免疫磁分离技术（IMS）与荧光分析技术结合的检测方法因其操作简单和性能稳定，被广泛应用于各种检测行业当中[9]。一方面，基于IMS技术可以利用包覆了细菌抗体的磁珠（MBs）从食品样品中有效的分离待检测目标菌[10];另一方面，由量子点构建的荧光探针在荧光分析中发挥着非常重要的作用，但在大多数的方法中都将其设计为抗体或适配体与量子点一对一的结合模式，大大降低了检测的灵敏度[11]。为了克服上述困难，本研究设计并构建了一种新型的自组装核-壳结构荧光量子点探针，该荧光探针由DNA量子点（DNA-QDs）和金纳米粒子（AuNPs）组成。金纳米粒子可以吸附结合大量的DNA量子点，在充分利用细菌上有限特异性结合位点的同时，极大地增强了单个细菌的荧光强度。另外，此新型荧光探针的整个制备过程可以由一般技术人员在很短的时间内通过简单的操作完成，且兼备成本低和环境友好的特性。

目前，量子点荧光探针已被广泛应用于多种行业的检测当中[12]。例如，在食源性致病细菌的检测中，荧光量子点与磁分离技术相结合，可以有效地对特定致病菌进行荧光检测和荧光分析。但不幸的是，大多数的荧光量子点（QDs）是在比较苛刻的条件下合成的，包括使用重金属、添加有毒试剂和配体、原材料昂贵、制备过程复杂等[13]。例如，胶体半导体量子点具有较长的荧光寿命，但其本身或其使用的溶剂（或配体）有毒，还需要使用重金属[14]。碳质量子点原材料廉价且无毒，但荧光寿命短，合成后还需要进一步纯化。另外，不同的量子点在应用于各种检测之前，还需要进行繁琐和复杂的表面修饰，对技术人员的要求较高，很难被一般的检测机构所掌握运用。与传统的QDs相比，DNA-QDs以廉价易得的单链DNA（ssDNA）为原料，在温和的水热条件下，通过DNA碱基间的相互作用，即能合成尺寸在1.6nm左右的生物量子点。此外，在DNA-QDs的合成过程中，DNA的碱基结构、主链上的PO4-1以及生物相容性都能被很好地保留下来[15]。因此，来源于DNA的量子点除了具有独特的荧光性质外，还具有生产工艺简单、荧光稳定、荧光寿命长、环保无污染、生物相容性好等优点[16]。

金纳米粒子因其独特的性质，如易于制备、生物相容性好和基本无毒性等而被广泛应用于各个研究领域[17]。在本研究中，AuNPs的制备仅需要添加聚乙烯亚胺（PEI）并进行搅拌。在室温条件下，快速搅拌PEI和HAuCl4，PEI分子链上的叔胺可以作为还原劑和稳定剂[18]，制备出的AuNPs-PEI尺寸在9nm左右。AuNPs-PEI的表面因PEI的包覆而富含大量的氨基，与带有PO4-1的DNA-QDs可以通过静电吸附作用即可自组装合成复合荧光探针，无须额外进行表面修饰，节省时间的同时也降低了技术难度。另外，金（Au）对巯基（SH基）具有很强的亲和性，修饰了SH基的适配体可以与纳米金粒子直接形成Au-S的配位共价键[19]，避免了繁琐的表面修饰。

本研究中设计以DNA量子点与金纳米粒子复合制备荧光探针，工艺简单、绿色环保、生产成本较低，由一个普通的技术人员通过简单的操作，在很短的时间内即可完成。此外，每个金纳米粒子作为载体可以吸附并结合大量的DNA-QDs后再连接到检测目标上，极大程度地增加了单位荧光强度，进而提高了检测灵敏度。在最佳的实验条件下，复合荧光探针在5fmol L-1到5.0×103fmol L-1的范围内可以成功检测到伤寒沙门氏菌DNA，检测限为7.5fmol L-1。因此，本研究设计的检测方案具有适用于普通技术人员应用于其他种类检测的潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氨基化磁珠（COOH-MBs，200-300nm）、三水氯金酸（HAuCl4·3H2O）、聚乙烯亚胺（PEI），以上试剂购自Sigma Aladdin公司;NHS、EDC、MES购自上海生工生物工程技术服务有限公司;DNA提取试剂盒购于碧云天生物技术有限公司;制备DNA量子点的单链DNA（序列：5′-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AAA AAA AAC CCC CCC CCC CCC C-3'）[20]，探针链接适配体（序列：SH-5′-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3′），磁珠连接适配体（序列：5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-biotin-3′），以上所有DNA序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 主要仪器

原子力显微镜（AFM）：MultiMode-8，德国Bruker;透射电镜（TEM）：JEM-2010，日本JEOL;紫外可见吸收光谱仪：750s，美国PerkinElmer;荧光光谱仪：FluoroMax-4，法国HORIBA;傅里叶红外光谱仪（FTIR）：Nicolet iS50，美国Thermo;X射线光电子能谱（XPS）：VG Multilab 2000X，美国Thermal Electron;激光动态光散射仪（DLS）：Nano ZS90，英国Malvern。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA-QDs的制备

首先，将500μg单链DNA粉末（序列为：5′-GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT GTG TGT AAA AAA AAC CCC CCC CCC CCC C-3′）装在小离心管中，使用离心机在4000r/min下离心3min，待DNA粉末充分沉降在离心管底部后轻轻打开盖子，加入500μL体积的超纯水使其充分溶解，得到的DNA溶液浓度最终为1 mg mL-1。然后，将DNA溶液放入置有聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中，在加热炉中进行水热反应，温度恒定在110°C反应10h。最后，将反应后的溶液取出并在室温下自然冷却，无须进一步分离和纯化即可得到粒径均匀的DNA-QDs溶液。

1.3.2 AuNPs的制备

将小烧杯使用新鲜配制的王水进行仔细清洗，再使用超纯水清洗干净，确保其中没有灰尘和杂质。首先，向小烧杯中加入20mL超纯水，再加入700μg的25000分子量的PEI，使溶液浓度为0.7mg mL-1，放置在磁力搅拌器上充分搅拌混匀。然后，向上述溶液中快速滴入HAuCl4（4mg mL-1， 2mL）溶液，封口后在室溫下持续搅拌24h即可得到粒径均一的AuNPs-PEI溶液。

1.3.3 AuNPs-PEI/DNA-QDs复合荧光探针的合成

将1mL浓度为1mg mL-1的DNA-QDs溶液快速加入1mL浓度为1mg mL-1的AuNPs-PEI溶液，涡旋30s后在室温下静置20min，置于4℃下备用。

1.3.4 适配体修饰探针的制备

将2μL浓度为1.0×10-5mol L-1的鼠伤寒沙门氏菌适配体（序列为：SH-5′-ATA TCC ACG CAG GAA ATA ACA GGA CTT-3′）溶液加入2mL的浓度为1mg mL-1的DNA-QDs/AuNPs探针并充分混合，在37℃下静置24h。然后，将上述混合溶液离心后重悬于2mL含有1%BSA的PBS（10mM，pH7.4）溶液中，置于4℃下备用。

1.3.5 适配体修饰磁珠的制备

取1mL浓度为5mg mL-1的氨基化的磁性纳米粒子（200-300nm）溶液，加入2mL含有5%戊二醛的PBS溶液中，在室温下处理4h。在外置磁场下利用磁分离技术，使用PBS溶液清洗3次后重悬于1mL的PBS溶液中。加入1mL浓度为0.3mg mL-1的亲和素，室温下静置4h后使用PBS溶液清洗3次后重悬于1mL的PBS溶液中，保存于4℃下备用。取0.5mL上述溶液，加入0.5mL浓度为1.0×10-8mol L-1的适配体（序列为：5′-GAG CGT GCC TTA CCG ACG ATA-biotin-3′）溶液，置于37℃下静置2h，利用磁分离技术使用PBS溶液清洗3次后置于4℃下备用。

1.3.6 沙门氏菌DNA的检测

首先，将沙门氏菌DNA（序列为：5′-TAT CGT CGG TAA GGC ACG CTC AAT TGT CGT TAA AGT CCT GTT ATT TCC TGC GTG GAT AT-3'）溶液按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的数量级浓度分别进行稀释。然后，分别取200μL的沙门氏菌DNA溶液与200μL的荧光探针溶液和200μL的磁珠溶液混合，在42℃下静置2h后利用磁分离技术使用PBS溶液清洗3次。最后，使用PBS溶液重悬后使用荧光光谱仪进行检测，同时计算出沙门氏菌DNA浓度与荧光强度间的线性关系。

1.3.7 对牛奶样品中沙门氏菌DNA的检测

以超市购买的包装牛奶为实际检测样本，使用本研究中设计制备的荧光探针对其中沙门氏菌DNA进行检测，验证探针的准确性和实用性。首先，根据国家标准平板计数法测得沙门氏菌溶液的浓度，并按照10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7的梯度浓度分别稀释细菌溶液。然后，分别将不同浓度的沙门氏菌溶液添加入所购买的牛奶样品当中，使用DNA提取试剂盒提取沙门氏细菌的DNA。最后，按照1.3.6中所叙述的方法检测提取后的DNA溶液，并根据沙门氏菌DNA浓度与荧光强度间的线性关系确定其荧光强度，以此来验证本方法的准确性和可靠性。

2 结果与讨论

2.1 DNA-QDs的表征

利用透射电镜观察DNA量子点的形态及大小，从图1中DNA量子点的TEM图可以观察到，DNA量子点是呈圆球形均匀分散的颗粒，其平均粒径为1.6nm，这也与其AFM图的结果相符。DNA量子点的光学性质分别使用紫外可见吸收光谱仪和荧光光谱仪进行检测，可以发现其紫外吸收峰在265nm，同时在不同激发波长下，DNA量子点的荧光发射光谱有所不同，从图1中得知，在360nm的激发光下，其最大发射波长为440nm附近。

2.2 DNA-QDs的结构分析

使用傅立叶红外光谱仪对DNA量子点进行检测，由图2中DNA量子点的红外光谱图能够观察到，DNA量子点和DNA分别在3454、2925、1633、1384和1116cm-1处有明显的红外光谱吸收峰。另外，使用X射线光电子能谱仪通过宽波段的XPS扫描对分析，可以发现分别在133（P2p）、284（C1s）、399（N1s）和531（O1s）eV处的四个典型峰值，证明DNA量子点的组成结构与DNA相似。综合以上结果，表明本研究所制备的DNA量子点基本保持了DNA原有的分子结构和生物相容性，其碱基结构和主链上的PO4-1基团都被很好地保留下来。

2.3 AuNPs的表征

通过透射电镜拍摄，由AuNPs的TEM图像中观察到，这些球形和分散良好的金纳米粒子的平均粒径大约为9nm。利用激光动态光散射仪测量AuNPs的尺寸分布，结果如图3中显示，AuNPs的分散系数为0.325，粒径分布在9nm左右，这与TEM的结果一致。

2.4 AuNPs-PEI/DNA-QDs的表征

从图4中可以看到，透射电镜图和动态光散射扫描结果清楚地揭示了DNA量子点与AuNPs之间复合结构的形成。从TEM图中观察到，复合DNA量子点后的AuNPs平均粒径由9nm变化到了11nm。同时，通过分析Zeta电位的变化可以知道，AuNPs在与DNA-QDs混合后，虽然仍保持着正电位，但AuNPs的zeta电位值发生了显著变化。从图中可以看到DNA-QDs/AuNPs探针的Zeta电位出现了两个显著的峰值，推测可能是由于AuNPs对DNA-QDs的不平衡吸附造成的。此外，将DNA-QDs和AuNPs混合后离心，用紫外可见吸收光谱仪和荧光光谱仪分别检测所分离得到的上清液的光学性质。图4中显示，上清液和DNA-QDs的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱进一步验证了AuNPs对DNA-QDs的吸附与结合。

2.5 复合探针对沙门氏菌DNA的检测

使用复合探针对鼠伤寒沙门氏菌的DNA进行测定，通过绘制细菌DNA浓度的对数曲线，可以发现沙门氏菌DNA浓度与其响应荧光强度呈线性关系，相關系数（R2）为0.9926。线性关系以方程式表示为Y=0.753X+4.393，其中Y和X分别表示激发波长360nm处的荧光强度和细菌DNA浓度在5fmol L-1到5.0×103fmol L-1之间的对数。用公式D=3N/S计算检测限的结果为7.5fmol L-1，其中N和S分别为空白样本信号的标准差和标准曲线的斜率。

2.6 使用复合探针对牛奶样品的检测结果

按照食品安全标准的要求，食品中如被检测出含有沙门氏菌是不能被食用的，为了验证本荧光探针的灵敏度和稳定性，使用从超市购买的牛奶为实际检测样本，在人为添加不同稀释浓度（10-1，10-2， 10-3，10-4，10-5，10-6，10-7）的沙门氏菌后用商品试剂盒提取其中的DNA，对其中沙门氏菌DNA进行检测。当稀释浓度为10-6时，已无法检测到荧光信号。因此，将稀释浓度为10-5的溶液再按照1倍、2倍、3倍、5倍稀释后进行检测，当稀释2倍时已无法检测到荧光信号。将稀释1倍后的荧光强度值代入2.5中的方程式进行计算，计算出检测限的结果为3.5fmol L-1。

3 结论

本研究首次利用AuNPs和DNA-QDs构建了一种新型的自组装核-壳结构荧光探针，用于检测伤寒沙门氏菌。PEI包被的AuNPs可以简化应用适配体修饰探针的繁琐过程，并通过静电吸附大量DNA-QDs来放大荧光信号。复合荧光探针在5fmol L-1到5.0×103 fmol L-1的范围内，沙门氏菌DNA浓度与其响应荧光强度呈良好的线性关系，相关系数（R2）为0.9926，方程式表示为Y=0.753X +4.393，检测限为7.5fmol L-1，可以有效地检测伤寒沙门氏菌DNA。同时，本探针在实际牛奶样品的检测中计算出检测限的结果为3.5fmol L-1，体现出了更好的准确性和稳定性，达到了灵敏检测的目的。

构成荧光探针的两种材料价格低廉、容易获取，一般技术人员只需简单操作，即可在短时间内完成整个检测过程。另外，本研究中所制备的荧光探针可以一次性制备后分多次使用，从而节省了反复制备的时间、减少了检测成本，并且这种新型探针还具有检测其他细菌和小分子的潜力，在食品安全、环境监测、医疗诊断和生物传感器等领域可能有着更广阔的应用前景。

——————————

参考文献：

〔1〕Dong H， Li C M， Zhang Y F， et al. Screen-printed microfluidic device for electrochemical immunoassay[J]. Lab Chip， 2007， 7（12）： 1752-1758.

〔2〕Nantaphol S， Channon R B， Kondo T， et al. Boron Doped Diamond Paste Electrodes for Microfluidic Paper-Based Analytical Devices[J]. Analytical Chemistry， 2017， 89（07）： 4100-4107.

〔3〕王杰，陈颖钰，彭清洁，等.沙门菌检测方法研究进展[J].动物医学进展，2016，37（04）：98-102.

〔4〕Lee K M， Runyon M， et al. Review of Salmonella detection and identification methods： Aspects of rapid emergency response and food safety[J]. Food Control， 2015， 47（47）： 264-276.

〔5〕赵平，杨光，丁松乔.食品中沙门氏菌检测研究进展[J].食品安全导刊，2016，5（05）：100-101.

〔6〕闰琳，王晓英，郭云昌，等.应用Taqman实时PCR法检测禽肉中沙门菌的研究[J].中華预防医学杂志，2014，48（08）：731-735.

〔7〕Hu J， Huang R， Wang Y， et al. Development of duplex PCR-ELISA for simultaneous detection of Salmonella spp and Escherichia coli O157： H7 in food[J]. Journal of Microbiological Methods， 2018， 154： 127-133.

〔8〕Darkhor P， Narmani A， Rezvani M， et al. Folic acid functionalized nanoparticles as pharmaceutical carriers in drug delivery systems[J]. Drug Development Research， 2019， 80（04）： 404-424.

〔9〕Zhang Z， Wang Q， Han L Y， et al. Rapid and sensitive detection of Salmonella typhimurium based on the photothermal effect of magnetic nanomaterials[J]. Sensors & Actuators B Chemical， 2018， 268： 188-194.

〔10〕Yu F， Xiong Y， Yu S， et al. Magnetic immunoassay using CdSe/ZnS quantum dots as  fluorescent probes to detect the level of DNA methyltransferase 1 in human serum sample[J]. International Journal of Nanomedicine， 2018， 13： 429-437.

〔11〕Wang B， Huang X， Ma M， et al. A simple quantum dot-based fluoroimmunoassay method for selective capturing and rapid detection of Salmonella Enteritidis on eggs[J]. Food Control， 2014， 35（01）： 26-32.

〔12〕Ropp C， Cummins Z， Nah S， et al. Nanoscale imaging and spontaneous emission control with a single nano-positioned quantum dot[J]. Nature Communications， 2013， 4（01）： 1447-1447.

〔13〕Galland C， Ghosh Y， Andrea S， et al. Lifetime blinking in nonblinking nanocrystal quantum dots[J]. Nature Communications， 2012， 3（01）： 908-908.

〔14〕Liu S， Tian J， Wang L， et al. Hydrothermal treatment of grass： A low-cost， green route to nitrogen-doped， carbon-rich， photoluminescent polymer nanodots as an effective fluorescent sensing platform for label-free detection of Cu（II） Ions[J]. Advanced Materials， 2012， 24： 2037-2041.

〔15〕Guo C X， Xie J， Wang B， et al. A new class of fluorescent-dots： long luminescent lifetime bio-dots self-assembled from DNA at low temperatures[J]. Scientific Reports， 2013， 3（01）： 2957-2957.

〔16〕Majumder S， Priyadarshini M， Subudhi U， et al. X-ray photoelectron spectroscopic investigations of modifications in plasmid DNA after interaction with Hg nanoparticles[J]. Applied Surface Science， 2009， 256（02）： 438-442.

〔17〕谢同彬， 梅林.基于纳米金复合探针的沙门氏菌快速定量检测[J].食品与机械，2017，3（11）：57-60.

〔18〕Virginia C， Francisco M S， Clara Y， et al. Size-dependent transfection efficiency of PEI-coated gold nanoparticles[J]. Acta biomaterialia， 2011， 7（10）： 3645-3655.

〔19〕Elahi N， Kamali M， Baghersad M H， et al. A fluorescence Nano-biosensors immobilization on Iron （MNPs） and gold （AuNPs） nanoparticles for detection of Shigella spp[J]. Materials Science and Engineering： C， 2019， 105： 110-113.

〔20〕Joshi R， Janagama H， Dwivedi H P， et al. Selection， characterization， and application of DNA aptamers for the capture and detection of Salmonella enterica serovars[J]. Molecular and Cellular Probes， 2009， 23（01）： 20-28.