槲皮素磁性分子印迹聚合物的制备

朱安宏,秦 政，涂清波

(南京中医药大学翰林学院药学院，江苏 泰州 225300)

槲皮素(quercetin，Qu)是一种含有多种生物活性的天然黄酮醇类化合物，在抗氧化、抑制肿瘤、抗菌、抗炎、防治糖尿病并发症等方面具有重要作用。天然产物中的槲皮素浓度很低，对其进行分离与提纯相对困难。近年来，分子印迹技术被广泛应用于天然产物活性成分的提取[1-3]。分子印迹聚合物(MIPs)由于对模板分子具有选择性识别的特性，受到研究者越来越多的关注。目前，采用分子印迹聚合物萃取槲皮素的研究较多[4]，但是在聚合物的吸附过程中，将目标物从复杂体系中分离需要反复多次抽滤和离心，分离效率较低。磁性纳米材料[5-8]，特别是稳定、廉价、易制备的Fe3O4，由于具有良好的磁学性能及稳定的物理和化学性质而被广泛应用于各个分离领域，可以实现从复杂的基体中迅速分离目标物。因此，磁性纳米材料结合分子印迹技术的研究也越来越多[9-11]。

作者以Fe3O4磁性纳米颗粒为载体、槲皮素为模板分子、丙烯酰胺(AM)为功能单体、无水乙醇为致孔剂，通过沉淀聚合法制备槲皮素磁性分子印迹聚合物(Qu/MMIPs)，采用扫描电镜和透射电镜对其形貌进行表征，并考察其吸附性能。

1 实验

1.1 试剂与仪器

槲皮素二水合物(98%)、丙烯酰胺(AM，98%)、2,2-偶氮二异丁腈(AIBN，98%)、二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA，98%)，上海阿拉丁试剂有限公司；乙二醇(EG)、聚乙二醇4000(PEG4000)、六水三氯化铁(FeCl3·6H2O)，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；超纯水；其它试剂均为分析纯。

KQ500B型超声波清洗仪，昆山超声仪器有限公司；ME104E型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；DHG-914385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱，上海新苗医疗器械制造有限公司；DF-202B型集热式恒温加热磁力搅拌器，上海凌科实业发展有限公司；TGL-16C型高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；UC-1800PC型紫外可见分光光度计，上海元析仪器有限公司；聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜(100 mL)，上海秋佐科学仪器有限公司；Dragon移液枪；索式提取器等。

1.2 Fe3O4磁性纳米颗粒的制备

采用水热法[12]制备Fe3O4磁性纳米颗粒。取20 mL EG溶液置于聚四氟乙烯不锈钢高压反应釜中，加入1.02 g FeCl3·6H2O、2.82 g CH3COONa、0.086 g PEG4000，溶解，搅拌均匀后，拧紧反应釜，密闭加热至200 ℃，反应12 h；取出后冷却至室温，依次用蒸馏水、无水乙醇超声洗涤黑色产物5 min，用磁石吸住黑色产物，将洗液除去；反复洗涤数次后，60 ℃下真空干燥24 h，即得Fe3O4磁性纳米颗粒。

1.3 槲皮素与功能单体的相互作用

1.3.1 溶液的配制

精密称取3.38 mg(0.01 mmol)槲皮素，置于100 mL容量瓶中，加入适量乙醇，超声使其充分溶解，冷却至室温后用乙醇定容至刻度，得浓度为0.1 mmol·L-1的槲皮素乙醇溶液，备用。精密称取0.01 mmol功能单体AM、甲基丙烯酸(MAA)和乙烯基吡啶(4-VP)，分别置于100 mL容量瓶中，加入适量乙醇，超声使其充分溶解，冷却至室温后用乙醇定容至刻度，得浓度均为0.1 mmol·L-1的AM、MAA和4-VP溶液，备用。

1.3.2 槲皮素与功能单体配比的选择

分别按槲皮素与功能单体AM配比为1∶0、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8配制混合标准溶液，静置3 h使其充分作用，用紫外分光光度计测定300～500 nm范围内的紫外光谱，确定适宜的配比。

1.3.3 功能单体的选择

以槲皮素为模板分子、无水乙醇为致孔剂，在不改变交联剂和引发剂用量的条件下，分别以AM、MAA和4-VP为功能单体，按模板分子与功能单体配比为1∶2、1∶4、1∶6制备分子印迹聚合物MIP1～MIP9，测定MIP1～MIP9对槲皮素的吸附量，确定适宜的功能单体。

1.4 Qu/MMIPs、MNIPs的制备

采用沉淀聚合法制备Qu/MMIPs。准确称取0.033 8 g(0.1 mmol)槲皮素模板分子、0.021 3 g(0.3 mmol)功能单体、500 mg Fe3O4磁性纳米颗粒置于装有50 mL无水乙醇的圆底烧瓶中，超声5 min混合均匀，室温下反应3 h；再加入20 mmol交联剂EGDMA、30 mg引发剂AIBN，通入氮气20 min后密封，80 ℃反应24 h；以甲醇-乙酸(9∶1，体积比)混合溶液为溶剂，采用索氏提取法洗脱产物，直至洗脱液中无槲皮素的紫外吸收，即分子印迹聚合物中模板分子已去除，60 ℃干燥过夜，即得Qu/MMIPs。

不加槲皮素模板分子，同法制备磁性非印迹聚合物MNIPs。

1.5 Qu/MMIPs的表征

采用扫描电镜和透射电镜对Fe3O4磁性纳米颗粒、Qu/MMIPs、MNIPs的形貌进行表征；通过分析磁滞回线，对Fe3O4磁性纳米颗粒、Qu/MMIPs的磁学性能进行表征。

1.6 Qu/MMIPs的吸附性能评价

1.6.1 吸附动力学实验

吸附动力学实验能反映聚合物的吸附量与吸附时间之间的关系[7]。分别准确称取500 mg Qu/MMIPs和MNIPs置于250 mL锥形瓶中，加入100 mL 0.01 mg·mL-1的槲皮素乙醇溶液，放入水浴振荡器中，常温下分别振荡20 min、40 min、60 min、80 min、120 min、180 min、240 min、300 min、360 min，取混合液1 mL，微孔过滤后稀释至5 mL，用紫外分光光度计测定其在254 nm处的吸光度，根据朗伯比尔定律确定槲皮素的平衡浓度。按下式计算聚合物对槲皮素的吸附量(Q，mg·g-1)，并绘制吸附量与吸附时间(t)的动力学吸附曲线。

式中：c0为槲皮素的初始浓度，mg·mL-1；ct为吸附平衡时槲皮素的浓度，mg·mL-1；V为槲皮素溶

液的体积，mL；m为Qu/MMIPs或MNIPs的质量，g。

1.6.2 等温吸附曲线的绘制

分别配制浓度(mg·mL-1)为0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14的槲皮素乙醇溶液，准确移取5 mL置于25 mL容量瓶中，加入50 mg Qu/MMIPs或MNIPs，用无水乙醇定容至刻度，常温下振荡3 h，离心，移取1 mL上清液稀释5倍后用紫外分光光度计测定其在254 nm处的吸光度，按1.6.1方法计算Qu/MMIPs和MNIPs对槲皮素的吸附量，绘制等温吸附曲线，并依据吸附量评价Qu/MMIPs和MNIPs的吸附性能。

2 结果与讨论

2.1 槲皮素和功能单体配比的选择

槲皮素与AM相互作用的紫外光谱如图1所示。

图1 槲皮素与AM相互作用的紫外光谱Fig.1 UV spectra for interaction between quercetin and AM

从图1可以看出，随着功能单体AM占比的增加，槲皮素和功能单体AM混合标准溶液的吸光度呈下降趋势，表明槲皮素与功能单体AM间的相互作用影响了槲皮素对紫外光的吸收，而且相互作用越大，吸光度变化量(ΔA)越大。当槲皮素与AM配比为1∶6时，相互作用趋于稳定，继续增加AM占比，对吸光度的影响较小。因此，选择槲皮素与AM的最佳配比为1∶6。

2.2 功能单体的选择

分子印迹聚合物MIP1～MIP9对槲皮素的吸附量见表1。

表1 分子印迹聚合物对槲皮素的吸附量

从表1可知，以MAA和4-VP为功能单体制备的分子印迹聚合物MIP4～MIP9对槲皮素的吸附量比以AM为功能单体制备的MIP1～MIP3小。主要是由于，槲皮素与AM之间的相互作用更强，两者之间形成更多的氢键。当槲皮素与AM配比为1∶6时，吸附量最大。这与配比选择实验结果相符。

2.3 形貌表征(图2)

图2 Qu/MMIPs(a)、MNIPs(b)、Fe3O4磁性纳米颗粒(c)的SEM照片及Qu/MMIPs的TEM照片(d)Fig.2 SEM images of Qu/MMIPs(a),MNIPs(b),Fe3O4 magnetic nanoparticles(c),and TEM image of Qu/MMIPs(d)

从图2可以看出，Qu/MMIPs与MNIPs都呈球状结构团簇在一起，粒径基本一致；Fe3O4磁性纳米颗粒粒径均一，约为600 nm。与Fe3O4磁性纳米颗粒粒径相比，Qu/MMIPs的粒径变大(图2d)，表明Fe3O4磁性纳米颗粒的表面包裹着分子印迹聚合物，成功制备了以Fe3O4磁性纳米颗粒为核心的磁性分子印迹聚合物。

2.4 磁学性能(图3)

图3 Fe3O4磁性纳米颗粒(a)、Qu/MMIPs(b)的磁滞回线及Qu/MMIPs在外磁场下的磁分离现象照片(c)Fig.3 Hysteresis loops of Fe3O4 magnetic nanoparticles(a),Qu/MMIPs(b) and photo for Qu/MMIPs magnetic separation phenomenon in external magnetic field(c)

从图3可以看出，Fe3O4磁性纳米颗粒和Qu/MMIPs的磁滞回线都是可逆的，不存在磁滞现象，其表征物理量矫顽力以及剩磁的数值大小几乎为零，在外磁场的作用下顺磁磁化率高于一般材料，展现出良好的超顺磁性。Fe3O4磁性纳米颗粒、Qu/MMIPs的饱和磁化强度分别为80.8 emu·g-1、54.3 emu·g-1，Qu/MMIPs的饱和磁化强度低是因为，在聚合过程中Fe3O4磁性纳米颗粒的表面包裹了一层分子印迹聚合物，对磁响应产生了一些影响，但并不影响Qu/MMIPs的磁学性能。当外部环境有磁场存在时，Qu/MMIPs能够迅速聚集到靠近磁铁的一边，溶液变得澄清透明(图3c)，从而可以迅速地将目标物从复杂基体中分离。Qu/MMIPs具有良好的磁效应，在外加磁场作用下分离效果明显，同时该方法制备的磁性分子印迹聚合物也适用于其它化学成分的富集分离。

2.5 动力学吸附曲线(图4)

图4 动力学吸附曲线 Fig.4 Dynamic adsorption curves

从图4可以看出，Qu/MMIPs和MNIPs对槲皮素的吸附量随吸附时间的延长而增大，特别是在初期，吸附量急剧增大，表明初期时的吸附速率很快，主要是由于Qu/MMIPs和MNIPs的非特异性吸附作用所致。Qu/MMIPs的整体吸附量大于MNIPs的，这是由于，MNIPs无印迹过程，聚合物表面没有特异性识别位点，对槲皮素的吸附属于物理吸附，即非特异性吸附；而Qu/MMIPs的表面存在大量的印迹位点，能与槲皮素在空间结构和官能团作用相匹配，对槲皮素特异性识别和吸附。40 min后，由于聚合物表面大量的印迹位点被槲皮素分子占据，槲皮素分子很难进入聚合物内部，传质阻力增大，从而使吸附速率变慢；60 min后，吸附量基本无变化，吸附达到平衡。

2.6 等温吸附曲线(图5)

图5 等温吸附曲线Fig.5 Isothermal adsorption curves

从图5可以看出，Qu/MMIPs、MNIPs对槲皮素的吸附量均随浓度的增加而增大，且Qu/MMIPs的吸附量大于MNIPs的；在浓度为0.04 mg·mL-1时，MNIPs对槲皮素的吸附趋于平衡，非特异性吸附达到饱和，吸附量基本不变。除了非特异性吸附外，Qu/MMIPs的表面还有大量对槲皮素特异性识别的印迹位点，且其内部也有很多印迹位点，又因为Qu/MMIPs内部的传质阻力较大，因此，Qu/MMIPs对槲皮素的吸附量虽然逐渐增大，但吸附速率逐渐减慢直到吸附平衡。

3 结论

以Fe3O4磁性纳米颗粒为载体、槲皮素为模板分子、AM为功能单体、无水乙醇为致孔剂，通过沉淀聚合法制备了Qu/MMIPs。Qu/MMIPs具有较好的磁学性能且对槲皮素模板分子具有特异选择性，可以从复杂的天然产物体系中快速有效地分离槲皮素。为天然产物中其它化学成分的分离纯化提供了一种新方法。