miR-135a靶向调控STAT6对前列腺癌细胞生物学行为的影响

赵宇明,张 悦，代 亮，张立民

(1.秦皇岛市第一医院 泌尿外科,河北 秦皇岛066000；2.秦皇岛市妇幼保健院 妇科,河北 秦皇岛066000)

前列腺癌属于一种在临床上较为常见的泌尿系统恶性肿瘤，流行病学调查显示，此病多发于中老年男性人群，目前随着临床上对前列腺癌的深入研究发现，此病的发生与年龄、种族和地理位置、遗传与家族史、雄激素、代谢综合征、生活习惯、饮食、基因等多因素相关[1,2]。手术、放疗、化疗等手段为前列腺癌的主要治疗方式，虽然在一定程度上改善患者症状，但部分患者复发转移率较高，其原因可能与癌细胞异常增殖、迁移、侵袭相关[3,4]。本文分析miR-135a靶向调控STAT6对前列腺癌细胞生物学行为的影响，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

DU145前列腺癌细胞株由中国科学院上海生命科学研究所提供。主要试剂：miR-135a NC、Hsa-miR-135a均由上海吉玛公司提供；Lipofectamine 2000试剂由Invitrogen公司提供；Takara逆转录试剂盒由美国GeneCopoeia提供；MTT试剂盒由艾美捷科技有限公司提供；小鼠抗大鼠MMP-2抗体、兔抗大鼠MMP-9抗体均由武汉益普生物科技有限公司提供；小鼠抗大鼠TIMP-2抗体由艾美捷科技有限公司提供；兔抗人Bcl-2抗体由上海雅吉生物科技有限公司提供；兔抗大鼠Bax抗体由武汉益普生物科技有限公司提供。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将DU145前列腺癌细胞株采用含10%胎牛血清、100 μg/mL青霉素、50 μg/mL链霉素双抗的DMEM培养基在温度为37℃、5% CO2、95%饱和湿度条件的孵育箱中做培养处理，根据细胞生长情况采用0.25%胰蛋白酶每周做传代处理，处理2次，当细胞稳定进入至对数生长期时用于后续试验。待细胞生长至培养皿底80%左右时，加2.5 g/L胰蛋白酶给予消化，1∶3传代，采集对数生长的第一代细胞，分为空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组3组。

1.2.2细胞转染 三组细胞每孔设置为3个复孔，分别加入100 μl 1×105个/mL细胞浓度的细胞悬液，培养至对数生长期，空白组加入常规细胞培养液、生理盐水做空白处理，miR-135a阴性对照组加入miR-135a NC、Lipofectamine 2000试剂行无义序列转染，miR-135a转染组加Hsa-miR-135a、Lipofectamine 2000试剂行转染。

1.2.3细胞miR-135a、STAT6 mRNA表达量检测 采用荧光定量RT-PCR技术鉴定miR-135a转染效率，并检测STAT6 mRNA表达量。取细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA，检测RNA纯度、含量，使用Takara逆转录试剂盒行逆转录处理后获得cDNA，采用Primer 5.0软件设计引物序列，采用2-△△Ct方法计算。反应体系：0.4 μl上下游引物、1 μl cDNA模板、10 μl SYB Green，加蒸馏水至20 μl。反应条件：95℃预变性1 min、94℃ 30 s、60℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，共进行30个循环。miR-135a引物序列：上游：5’-CCGACGCGTTCTTTTCTGTTGCCCCATC-3’，下游：5’-CCCA-AGCTTGGACCGCAGCACCTATCT-3’；STAT6引物序列：上游：5’-AGGAGAGCAGGGGAAAGGAAG-3’，下游：5’-TGGCAGGTGGTGGAACTC-TT-3’。内参基因U6引物序列：上游：5’-CTCGC-TTCGGCAGCACA-3’，下游：5’-AACGCTTCAC-GAATTTGCGT-3’。

1.2.4细胞增殖检测 使用MTT比色法检测三组细胞增殖情况，在细胞培养后将细胞浓度调整至3×104个/ml，接种于96孔板中，将200 μl细胞悬液加入至每孔中，在37℃、5% CO2环境下培养24 h、48 h、72 h后，加入10 μl MTT试剂继续孵育4 h，采用酶标仪测定波长为570 nm的细胞组OD值，计算三组细胞增殖率。细胞增殖率=(细胞组OD值/参照组OD值)×100%。

1.2.5细胞凋亡检测 使用DxFLEX流式细胞仪、Annexiv-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒，检测各组细胞凋亡情况，采用PBS重复洗涤细胞2次，取另一支试管，加入70%预冷的乙醇5 ml，用吸管吸取细胞悬液迅速吹入固定剂中(乙醇)振荡混匀，4℃冰箱固定至少18 h。将离心固定后的细胞，用PBS洗2次，细胞浓度调整为为1×106个/ml，取1 ml，离心处理后将上清液弃除，加入1 ml PI染液，4℃冰箱避光染色30 min后上机检测，记录激发波长488 nm处荧光。

1.2.6细胞迁移检测 采用细胞划痕实验检测细胞迁移能力，实验步骤：将细胞接种至18孔板待其增长到80%时，使用100 μl的枪头,垂直划出3条直线，使用PBS缓冲液清洗2-3次，分别加入0.5 %的血清培养基，观察24 h之后，使用倒置显微镜观察三组细胞的迁移数量。

1.2.7细胞侵袭检测 采用Transwell小室检测三组细胞侵袭能力，培养板中放置Transwell小室，细胞悬液接种于上室，100 ng/ml IL-8接种于下室，24 h后100 μg/ml TMP溶液入至下室，孵育24 h，将上室微孔中的细胞使用棉签擦除，PBS反复洗涤3次(每次洗涤3 min)后，将其固定于4%多聚甲醛溶液中，固定处理15 min，使用苏木精染色处理10 min，再次使用PBS洗涤，在倒置显微镜下观察上室微孔下层的细胞数，观察三组细胞侵袭能力。

1.2.8MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白检测 采用Western Blot法检测细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表达量，将细胞行10000×g离心处理10 min，对上清液进行提取后，BCA进行蛋白定量检测，在2×SDS凝胶缓冲液中加入50 μg蛋白，在100℃环境中加热5 min。凝胶电泳完转膜，取膜，4 ℃环境下在5%脱脂牛奶中固定、封闭处理时间为1 h，一抗使用0.05%-0.1% TBST稀释(MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax一抗为1∶1000)，4℃孵育过夜保存，之后使用0.05%-0.1% TBST洗膜，3次，每次为5 min，二抗被0.05%-0.1% TBST稀释(1∶10000)，摇动孵育时间为 1 h，再次采用TBST连续洗膜3次，处理时间为5 min，DAB显色，定量分析蛋白表达情况，以GAPDH为内参。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 转染效率鉴定结果

如表1所示，与空白组相比，miR-135a阴性对照组miR-135a表达量降低，miR-135a转染组miR-135a表达量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明miR-135a转染成功。

2.2 三组细胞STAT6 mRNA表达量对比

如表2所示，空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组STAT6 mRNA表达量比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；与miR-135a阴性对照组相比，miR-135a转染组STAT6 mRNA表达量降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 转染效率鉴定结果

表2 三组细胞STAT6 mRNA表达量对比

2.3 三组细胞增殖、凋亡情况比较

如表3所示，空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组增殖、凋亡率比较，空白组、miR-135a转染组均比miR-135a阴性对照组miR-135a转染组增殖率降低，凋亡率升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表3 三组细胞增殖、凋亡情况比较

2.4 三组细胞侵袭、迁移情况比较

如表4、图1-2所示，空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组侵袭、迁移个数比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；与miR-135a阴性对照组相比，miR-135a转染组侵袭、迁移个数降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表4 三组细胞侵袭、迁移情况比较

图1 三组细胞侵袭能力比较

图2 三组细胞迁移能力比较

2.5 三组细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表达量比较

如表5、图3所示，空白组、miR-135a阴性对照组、miR-135a转染组MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表达比较，差异具有统计学意义(P<0.05)；与miR-135a阴性对照组相比，miR-135a转染组MMP-2、MMP-9、Bcl-2蛋白表达量降低，TIMP-2、Bax蛋白表达量升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表5 三组细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax相关蛋白表达量比较

3 讨论

微小RNA(miRNA)属于一类较为重要的具有调控细胞发育、增殖、分化、应激的内源性单链非编码小RNA分子，在转录水平上可调控多种基因的表达，使其降解和抑制翻译过程[5]。目前临床上随着对前列腺癌的不断深入研究发现，miRNA异常表达与此病的发生密切相关，可经调控基因表达发挥其促进肿瘤形成、进展、转移过程。miR-135a为miR-135家族成员之一，其具有抑制癌细胞增殖、促进癌细胞凋亡的作用，在多种恶性肿瘤的发生发展中具有重要的作用[6]。有研究发现，miR-135a在喉癌[7]、胶质瘤[8]、胃癌[9]、非小细胞肺癌[10]中异常表达，其可经一系列的作用途径促进癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡。Xu B等[11]在其研究中发现激素依赖前列腺癌组织中miR-135a的表达均高于激素非依赖前列腺癌组织，推测miR-135a表达异常亦可能与前列腺癌进展有关。本研究中构建miR-135a慢病毒载体，转染至前列腺癌细胞中，结果显示，转染miR-135a后的前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭能力均被显著抑制，且凋亡率显著升高，提示，miR-135a与前列腺癌进展相关，提高其表达抑制癌细胞增殖、迁移，阻止疾病恶化，提高患者生存周期。

图3 三组细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表达量WB图

STATs属于一类与细胞生长分化、细胞增殖、细胞凋亡、细胞免疫反应、恶性肿瘤发生的一种DNA结合蛋白，当其与分布于细胞表面的细胞因子受体发生特异性结合后会出现酪氨酸残基磷酸化，形成二聚体，使其被激活，从细胞质中转移至细胞核中，对其相应的细胞因子转录过程产生诱导作用[12,13]。STAT6为STAT家族成员之一，其相对分子量大约为94×103，可经作用于JAK-STAT信号转导途径促进多种细胞因子活化，参与机体多种生理病理变化过程，最终促进疾病的发生[14,15]。研究发现，miR-135a作用的靶基因为STAT6。本文研究结果显示，经转染miR-135a培养的前列腺癌细胞STAT6表达量显著降低，此结果提示miR-135a可能经抑制STAT6表达，发挥其抑制癌细胞增殖、迁移、侵袭，促进凋亡的作用。

细胞增殖、凋亡过程与多基因相互作用相关，Bcl-2家族与此密切相关，Bcl-2家族包括抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax，两者相互作用，促进癌细胞增殖，抑制癌细胞凋亡[16,17]。本文结果显示，miR-135a转染的前列腺癌细胞MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax蛋白表达明显改善，提示着miR-135a转染抑制前列腺癌细胞迁移、侵袭增殖的机制可能与作用于STAT6，调控MMP-2、MMP-9、TIMP-2、Bcl-2、Bax表达相关。