中药补肾活血汤对2型糖尿病肾病大鼠血清胱抑素C及血、尿β2微球蛋白的机制研究*

熊 丹，胡 维，黄 娟

（湖南中医药大学第一附属医院，长沙 410007）

糖尿病肾病（DN）是糖尿病慢性微血管的常见并发症，也是导致终末期肾病的重要原因，全国慢性肾功能衰竭病因调查结果显示糖尿病因素居第2位[1]。绝大部分早期肾损害患者无临床症状或缺乏特异性，尿常查和肾功能检查也多无异常，给早期诊治带来较大困难。近些年有研究表明在DN早期，血清胱抑素c（Cys-c）与血、尿β2微球蛋白（β2-MG）上升更早于血清尿素氮（BUN）和血肌酐（Cr），可作为早期DN诊断及疗效评价的敏感指标[2]。DN属中医“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴，以气阴两虚为本，瘀血阻络为标，病位在肾，气阴两虚、瘀血阻络是基本病机。根据DN中医病机特点和辨证施治思想，本研究建立早期2型DN气阴两虚病证结合实验模型，探讨运用中药补肾活血汤对2型DN大鼠血糖、BUN、Cr、24 h 尿白蛋白（24 h-UAlb）、Cys-c及血、尿β2-MG的影响，分析其可能作用机制，评价补肾活血汤对2型DN的治疗作用，详细报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲料 本次实验共收集SPF级Wistar雄性大鼠65只，体质量100～130 g，平均（114.5±10.6）g，均购自湖北省疾病控制中心实验动物中心。高脂饲料按照基础饲料87.5%、猪油10%、胆固醇粉2%、胆酸钠粉0.5%的比例混合配制。

1.2 试剂和仪器 试剂盒：血糖试剂盒购自南京建成生物工程研究所；BUN、Cr试剂盒购自北京恩济和生物有限公司；血、尿β2-MG试剂盒购自深圳新产业生物医学工程股份有限公司；Cys-c试剂盒购自山东博科生物产业有限公司；尿微量白蛋白（umAlb）试剂盒购自山东博科生物产业有限公司。仪器：美国强生公司one Touch Ultrall稳豪血糖仪，美国CD-1600全自动生化分析仪，日本奥林巴斯BX-51显微镜和DP70图像采集系统。

1.3 实验模型 参考文献[3]建立2型DN“气阴两虚证”大鼠模型。65只大鼠适应性喂养7 d后进行血糖、血压、血脂、体质量等常规测量，均确保无指标异常大鼠。随机选取其中15只大鼠作为假手术组，余下50只作为模型制备对象。建立早期气阴两虚型2型DN病证结合大鼠模型，具体方法：1）单肾切除：除假手术组外，大鼠常规1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉消毒后，行背部切口1.5 cm，剥离肾脏脂肪、肾上腺，左肾门血管结扎，切除左肾后缝合切口，术后常规处理。假手术组切口后仅行暴露左肾、缝合切口处理。2）高脂饲料：除假手术组外，单肾切除术后7 d给予高脂饲料正常喂养，假手术组给予基础饲料喂养，持续2周。3）链脲佐菌素（STZ）腹腔注射：除假手术组外，均给予STZ 30 mg/kg腹腔注射，假手术组注射等剂量0.1 mmol/L柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液。72 h后行口服葡萄糖耐量（OGTT）实验，血糖仪检测空腹血糖（FBG）≥5.6 mmol/L或负荷后2 h血糖≥7.8 mmol/L表示模型初步建立。4）行为干预：除假手术组外，采用饥饱失常、劳逸无度、惊吓刺激等途径干预，假手术组继续常规饲养。

1.4 模型分组及处理 参考文献[4]进行行为干预，除假手术组外，采用随机数字表法将余下50只模型制备大鼠分为模型组（15只）、补肾活血组（20只）、贝那普利组（15只）。其中补肾活血组给予中药补肾活血方10 g/（kg·d）灌胃，补肾活血汤由黄芪、太子参、生地、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、五味子、赤芍、三七等中药组成，用“水煮醇提法”制备成浸膏，用生理盐水稀释成含生药2.5 g/mL的溶液。贝那普利组采用贝那普利（诺华制药）10 mg/（kg·d）灌胃处理，用生理盐水稀释成2 mg/mL的溶液。假手术组、模型组两组给予饮用纯净水灌胃处理，灌胃纯净水体积同补肾活血组、贝那普利组灌胃药液体积，4组均于连续灌胃处理20周。若研究中途有大鼠死亡则予以剔除。

1.5 标本采集及检测方法 均于实验结束前1周采用金属代谢笼收集24 h尿标本，记录尿量后取10 mL尿标本。OGTT实验结束后禁食12 h，以戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血，分离血清，以备检测。血糖[FBG、餐后2 h血糖（PBG）]测定用葡萄糖氧化酶法，超氧化物歧化酶（SOD）用黄嘌呤氧化酶法，丙二醛（MDA）用硫代巴比妥酸（TBA）比色法，BUN用尿素酶-谷氨酸脱氢酶法，Cr用酶联免疫吸附法，umAlb用免疫透射比浊法，血、尿β2-MG用化学发光法，Cys-c用免疫比浊法，所有指标均严格按试剂盒说明书进行检测。剥离摘取大鼠右侧肾脏，冰生理盐水清洗后吸干表面水分，10%福尔马林固定72 h，制备4 μm石蜡切片，苏木精-伊红染色，光镜下观察各组大鼠肾组织病理特征。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0软件分析处理，计量资料用均数±标准差（±s）表示，多组间差异比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验模型大鼠基本情况 假手术组：大鼠体态正常，进食、饮水、排泄、运动、睡眠等均正常，无死亡；模型组：大鼠体态衰弱，毛发稀少枯黄，四肢纤瘦乏力，少动嗜睡，排泄习惯及排泄物形态异常，死亡2只；补肾活血组：大鼠体态稍次于假手术组，明显优于模型组，大鼠进食、饮水、睡眠习惯、排泄等基本正常，毛发略有干枯，颜色略微暗淡，运动量稍有减少，死亡1只；贝那普利组大鼠体态次于假手术组、补肾活血组，优于模型组，大鼠进食、饮水、运动量有一定减少，排尿次数增多，毛发干枯稀少，毛发枯黄，四肢纤瘦乏力，死亡2只。

2.2 不同分组大鼠FBG、PBG指标比较 与假手术组比较，模型组、补肾活血组、贝那普利组血FBG、PBG均显著偏高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血组血FBG、PBG明显偏低，差异有统计学意义（P＜0.01），贝那普利组差异无统计学意义（P＞0.05）。见表 1。

2.3 不同分组血清和肾皮质SOD、MDA比较 与假手术组比较，模型组、补肾活血组、贝那普利组血清和肾皮质MDA均升高，SOD下降，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血组、贝那普利组血清和肾皮质MDA更低，SOD更高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与贝那普利组比较，补肾活血组血清和肾皮质SOD、MDA也明显更优，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表 2。

表1 各组大鼠FBG、PBG检测结果比较（±s）mmol/L

表1 各组大鼠FBG、PBG检测结果比较（±s）mmol/L

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.01。

组别 n F B G P B G假手术组 1 5 4.1 3±0.4 0 5.3 6±0.6 4模型组 1 3 8.5 0±1.1 8* 1 4.0 5±2.7 1*补肾活血组 1 9 7.2 3±0.8 6*# 1 0.6 6±1.8 9*#贝那普利组 1 3 8.0 5±0.9 7* 1 2.7 3±2.1 5*

表2 不同分组大鼠血清和肾皮质MDA、SOD比较（±s）

表2 不同分组大鼠血清和肾皮质MDA、SOD比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与贝那普利组比较，△P＜0.05。

S O D（U/m L）假手术组 1 5 2.9 1±0.4 2 2 8 4.6 2±2 2.7 4 1.3 1±0.0 5 1 0 2.6 5±2 4.8 0模型组 1 3 5.0 2±0.4 6* 1 8 5.9 4±2 4.3 6* 2.5 0±0.5 4* 7 2.6 9±1 2.5 7*补肾活血组 1 9 4.1 0±0.5 1*#△ 2 4 7.5 0±2 9.7 0*#△ 2.0 1±0.3 5*#△ 9 4.0 9±1 5.3 1*#△贝那普利组 1 3 4.3 5±0.6 7*#2 1 8.3 8±1 8.9 5*#2.1 5±0.4 1*# 8 5.1 3±1 4.5 0*#组别 n血清 肾皮质M D A（n m o l/m L）S O D（U/m L）M D A（n m o l/m L）

2.4 不同分组大鼠肾功能 BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG指标比较 与假手术组相较，模型组、补肾活血组、贝那普利组BUN、Cr均升高，但无统计学差异（P＞0.05），模型组、补肾活血组、贝那普利组24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG均偏高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，补肾活血组、贝那普利组 24 h-UAlb、Cys-c、血尿 β2-MG均降低（P＜0.05）；模型组与贝那普利组比较，24 h-UAlb、Cys-c、血尿β2-MG差异无统计学意义（P＞0.05）。见表3。

2.5 各组大鼠肾组织病理特征 假手术组大鼠光镜下可见清晰肾小管、小管间质区结构，肾小管上皮细胞大小及排列正常，基底膜完整。模型组可见局部肾小管间质纤维化，并伴有明显炎性细胞浸润和肾小球系膜细胞增生，肾小管上皮细胞可见脱落和颗粒变性等。补肾活血组可见肾小管、小管间质区结构等基本正常，伴有部分肾小球系膜细胞轻度增生和少量肾小管上皮细胞颗粒变性。贝那普利组可见局部肾小管间质轻度纤维化和炎性细胞浸润，伴有肾小管水肿、细胞颗粒变性和肾小球萎缩等。各组大鼠肾组织病理特征病变程度由正常至严重依次为假手术组、补肾活血组、贝那普利组、模型组。

3 讨论

DN的发病机制目前尚不明确，早期进行有效诊治可延缓病情的进展。血清Cys-c是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，主要由机体所有有核细胞产生。循环中的Cys-c可经肾小球自由滤过，在近端肾小管上皮细胞被完全分解，肾脏是唯一清除Cys-c的器官，因此，血清Cys-c是一种反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物[5]。研究表明血清Cys-c与肾小球滤过率呈良好的线性关系，且早于、优于Cr，检测血清Cys-c可明确DN的进展情况[6]。β2-MG由淋巴细胞等合成并分泌到血液及体液中，血液中的β2-MG可以从肾小球自由滤过，99.9%在近端肾小管吸收，并在肾小管上皮细胞中被分解[7-8]。当肾小球滤过功能下降时，血β2-MG开始升高，因而能够及时反映肾小球滤过功能的损伤[7]；当肾小管功能发生异常时，重吸收功能下降，尿β2-MG含量升高[9]，因而尿β2-MG是诊断肾小管功能损伤，尤其是近曲小管功能损伤的敏感性指标。李波等[10]的临床试验结果显示血清Cys-c、β2-MG比Cr、BUN能更敏感、更准确地反映肾小球滤过率，对早期诊断肾功能损害具有重要临床价值。

DN属中医“消渴”“水肿”“尿浊”等范畴，以气阴两虚为本，瘀血阻络为标，病位在肾。患者消渴日久，化燥伤阴耗气，终致气阴两虚；气虚则气血津液运行不畅，瘀血、痰浊阻络。根据DN气阴两虚、瘀血阻络的基本病机，本研究采用中药补肾活血汤辨证治疗，配方由黄芪、太子参、生地、山药、山茱萸、茯苓、牡丹皮、三七、五味子等配伍而成，方中黄芪、太子参、山药健脾益气，使气行血行。黄芪味甘性温，可温补肺、脾、肾，疏利三焦，利水消肿[11]。生地清热凉血，养阴生津。山茱萸补益肝肾，收敛固涩。现代药理学证实生地、山茱萸治疗DN具有协同增益作用，可有效抑制DN患者糖基化产物产生，抑制细胞外基质（ECM）增生和转化生长因子（TGF）-β表达，改善或延缓DN肾小球硬化[12]。茯苓健脾渗湿、利水消肿。牡丹皮清热凉血，活血化瘀。三七止血散瘀，补虚消肿。五味子益气生津，补肾宁心。诸药配伍共奏滋补脾肾、活血通络和益气养阴之功效。

表 3 各组大鼠 BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血 β2-MG、尿 β2-MG 检测结果比较（±s）

表 3 各组大鼠 BUN、Cr、24 h-UAlb、Cys-c、血 β2-MG、尿 β2-MG 检测结果比较（±s）

注：与假手术组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05。

组别n B U N（m m o l/L）C r（m m o l/L）假手术组 1 5 5.2 4±0.5 9 3 9.0 6±6.1 5模型组 1 3 5.7 5±0.9 4 4 4.5 3±6.8 4补肾活血组 1 9 5.2 3±0.6 1 4 1.6 7±5.7 6贝那普利组 1 3 5.5 7±0.7 4 4 2.8 1±5.9 7 2 4 h-U A l b（μ g/2 4 h）1 6 8.4 1±2 9.3 7 1 4 2 8.5 4±3 2 7.6 3*8 9 6.4 0±2 4 1.4 8*#9 1 7.2 9±2 7 5.9 1*#C y s-c（m g/m L）0.0 7 8±0.0 1 7 0.1 5 7±0.0 2 8*0.1 2 2±0.0 2 3*#0.1 2 4±0.0 1 7*#血 β 2-M G（n m o l/m L）0.0 3 4±0.0 1 2 0.1 2 5±0.0 3 7*0.0 9 4±0.0 1 1*#0.0 9 7±0.0 1 6*#尿 β 2-M G（m m o l/m L）0.0 0 9 1±0.0 0 1 7 0.0 1 4 3±0.0 0 3 1*0.0 1 0 7±0.0 0 2 8*#0.0 1 2 9±0.0 0 2 7*#

本研究显示模型组大鼠的血糖、血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均明显升高，但肾功能尚正常，血清BUN、Cr升高并不显著，符合早期气阴两虚型2型DN特点。补血活血组和贝那普利组用药治疗20周后，大鼠血清Cys-c、血、尿β2-M、24 h-UAlb均较模型组降低（P＜0.05），且两组疗效相近，与胡爱民等[13]报道结论相吻合，证实了补肾活血方能改善2型DN的肾功能，对肾脏具有保护作用。

本研究还对补肾活血汤保护肾脏功能的作用机制进行探究，结果显示模型组、补肾活血组和贝那普利组大鼠血清和肾皮质MDA均明显高于假手术组，SOD水平显著下降，提示DN大鼠存在氧化应激损伤，与DN的发生及进展可能存在紧密关联。DN大鼠高糖诱导线粒体呼吸链产生的活性氧（ROS）超过抗氧化物质的清除能力，会诱导氧化应激发生。其参与DN的发生、进展机制可能是：ROS损伤足细胞、内皮细胞等破坏肾小球滤过屏障；ROS上调系膜细胞内纤溶酶-1（PAI-1）表达和下调纤溶酶原激活剂（PA）表达，抑制肾小球系膜细胞降解ECM的能力，引起ECM沉积和肾内机制重构、肾小管间质纤维化等；ROS参与肾小球内高压的形成等。此外有报道指出补肾活血中药方可能通过降低TGF-β1、miR-192等表达，提高Smad相互作用蛋白1（SIP1）表达等途径保护DN大鼠肾脏功能[14]，在后续研究有待深入完善。