黄连、黄芩对鲍曼不动杆菌的体外抑制作用研究

倪建腾，马致洁，章从恩，赵奎君(首都医科大学附属北京友谊医院中药剂科，北京 100050)

鲍曼不动杆菌是一种非发酵阴性不动杆菌，近年来已成为我国医院现存的主要条件致病菌[1];其耐药性强，传播途径广[2];临床主要采用抗菌药物治疗[3]。由本课题前期分析“2016上半年鲍曼不动杆菌感染的临床用药情况”的结论可知，抗菌药物联合应用手段在治疗鲍曼不动杆菌感染方面并没有绝对的优势，抗菌药物耐药问题依然严峻。因此，寻找新思路、新途径来抑制鲍曼不动杆菌是临床急需解决的难题。如果某药能在相同的药效水平下减少抗菌药物的用量，就会降低抗菌药物致使鲍曼不动杆菌产生耐药性的风险，从而降低鲍曼不动杆菌的耐药率。

课题组前期对临床治疗鲍曼不动杆菌感染颇有功效的中药复方进行了用药分析，结果显示，黄芩的用药频率为5.15%，居首位；而黄连的用药频率为4.44%，居其次。黄连来源于毛茛科植物黄连、三角叶黄连或云连，上述植物根茎富含多种异喹啉类生物碱。翟华强等[4]通过动物实验确认黄连外用具有明显的抗炎作用。李立津等[5]和杨春梅等[6]报道了小檗碱具有消除细菌的耐药质粒的能力，可以降低细菌对药物的耐药性。黄芩来源于唇形科植物黄芩的根，具有清热燥湿、泻火解毒的功效，现代研究结果发现，黄酮类物质和皂苷类物质是黄芩发挥生物活性的主要成分，具有抗菌、抗病毒及体外抑菌作用[7-9]。因此，黄连、黄芩在抑制鲍曼不动杆菌或优化抗菌药物应用等领域具有很大潜力。

鉴于临床中药复方多选用水煎法服用，故本研究旨在观察黄连、黄芩水提物与替加环素联合体外抑制鲍曼不动杆菌的作用，在此基础上进一步观察黄芩苷、盐酸小檗碱与替加环素联合体外抑制鲍曼不动杆菌的作用，为临床治疗鲍曼不动杆菌感染提供新的用药思路。

1 材料

1.1 仪器

生物安全柜(新加坡艺思高科技有限公司)；麦氏比浊仪(梅里埃生物制品有限公司)；96孔平底培养板(康宁公司)；恒温细菌培养箱(北京诚茂兴业科技发展有限公司)；冰箱(武汉新世界制冷工业有限公司)；涡旋混合器(上海五相仪器仪表有限公司)；离心机(艾本德股份公司)；移液器(艾本德股份公司)；电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)；Gradient A10 Mill-Q超纯水器(法国 Millipore 公司)。

1.2 药品与试剂

鲍曼不动杆菌标准菌株(中国工业微生物菌种保藏管理中心)；肉汤粉(北京陆桥技术有限责任公司)；血平板(梅里埃生物制品有限公司)；黄芩饮片(北京华邈药业有限公司)；黄连饮片(北京人卫中药饮片厂)；黄芩苷标准品(中国药品生物制品检定所)；盐酸小檗碱标准品(中国药品生物制品检定所)；替加环素标准品(浙江海正药业股份有限公司)；0.9%氯化钠溶液(石家庄四药有限公司)；吐温80(北京迈瑞达科技有限公司)；二甲基亚砜(德国Sigma公司)。

2 方法

2.1 药液制备

鉴于临床用药规律，中药复方多为水煎服用，故本研究采用水提法。取黄连25.00 g，用8倍纯净水浸泡20 min，煎煮30 min，三层纱布过滤，再加入6倍纯净水，煎煮20 min，合并两次滤液，浓缩至300 ml后，得到黄连水提物，浓度为83.33 mg生药/ml，相当于生药浓度。用肉汤稀释至30.00 mg/ml，离心(2 000 r/min，5 min)后取上清液，再用肉汤2倍倍比稀释为15.00、7.50、3.75、1.88及0.94 mg/ml，置于涡旋混匀器中充分混匀。同法得到15.00、7.50、3.75、1.88及0.94 mg/ml的黄芩水提物。小量分装，将其置于4 ℃冰箱冷藏保存。

取适量黄芩苷标准品(C21H18O11，分子量为446.37)溶于二甲基亚砜中，配至浓度为10.34 mmol/L。取290 μl于盐钵中，加入0.40 ml吐温80研匀，用肉汤定容至1.50 ml，充分混匀，得到黄芩苷工作液，浓度为2 000.00 μmol/L。再用肉汤稀释为200.00、100.00、50.00、25.00及12.50 μmol/L，充分混匀后小量分装。同法得到200.00、100.00、50.00、25.00及12.50 μmol/L的盐酸小檗碱溶液。均置于4 ℃冰箱冷藏保存。

取适量替加环素标品(C29H39N5O8，分子量为585.65)溶于肉汤中，配至浓度为4.27、2.14、1.07、0.53及0.27 μmol/L，充分混匀，得到替加环素药液，小量分装后置于4 ℃冰箱冷藏保存。

2.2 96孔板制备

2.2.1 药物单用：取黄连药液40 μl依照浓度由低至高依次加入96孔板的第2—6列，B—G行每行浓度相同；在2—7列(B—G行)加入菌悬液20 μl，在第2—6列(B—G行)加入肉汤40 μl，第7列(B—G行)加入肉汤80 μl，第8列加入肉汤100 μl。此时第7列为生长对照，第8列为空白对照，B—G行为6组平行实验。黄连水提物的终浓度由低至高依次为0.38、0.75、1.5、3.00和6.00 mg/ml；鲍曼不动杆菌的终浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml(上述体系中二甲基亚砜含量均≤1%，可忽略其对菌体生长的影响)，轻微震荡以充分混匀，得到黄连单用抑制鲍曼不动杆菌培养板。同法得到黄芩、盐酸小檗碱和黄芩苷单用抑制鲍曼不动杆菌培养板，均放置于35 ℃恒温细菌培养箱中培养16 h。

2.2.2 药物联合应用：取黄连药液40 μl按浓度递增顺序由左向右依次注入96孔板的第3—7横排孔中，共注入6(B—G)行；取替加环素药液40 μl按浓度递减顺序由上向下依次注入96孔板的第B—F竖排孔中，共注入6(2—7)列；以上各孔除B7孔外均加入菌悬液20 μl，另外在G2孔加入菌悬液20 μl，不足100 μl的孔均用肉汤补齐。此时，B7孔为空白对照，G2孔为生长对照，黄连的终浓度由低至高依次为0.38、0.75、1.5、3.00和6.00 mg/ml；替加环素的终浓度为0.11、0.21、0.43、0.86和1.71 μmol/L；鲍曼不动杆菌的终浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml(上述体系中二甲基亚砜含量均<1%，可忽略其对菌体生长的影响)，轻微震荡以充分混匀，得到黄连联合替加环素抑制鲍曼不动杆菌培养板。同法得到黄芩、盐酸小檗碱和黄芩苷联合替加环素抑制鲍曼不动杆菌培养板，均放置于35 ℃恒温细菌培养箱中培养16 h。

2.3 接种和培养

取出96孔板各孔培养液10 μl，用灭菌生理盐水稀释106倍，再取稀释菌液5 μl于血平板中，使用接种环“Z”字形充分涂开，放置于35 ℃恒温细菌培养箱中培养16 h[10]。再根据平板上的活菌计数和稀释度，按下列公式计算抑制率：各孔所有标本种活菌数量=20×稀释倍数×菌落个数；抑制率=(1-各孔中的细菌数/生长对照孔中细菌数)×100% 。以上实验重复6遍，计数时取其菌落的平均数。

2.4 统计学方法

本课题拟采用体外抑菌实验，模拟临床的用药方法，观察鲍曼不动杆菌在黄连、黄芩、盐酸小檗碱及黄芩苷等抗菌药物作用下的生长变化；为进一步总结替加环素单用对比黄连、黄芩、盐酸小檗碱和黄芩苷分别与替加环素联合应用的抑菌效果，本课题采用单因素方差分析进行研究，计算并使用SPSS软件进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同浓度黄连、黄芩水提物对鲍曼不动杆菌的抑制率比较

当药物浓度相同时，黄连组对鲍曼不动杆菌的抑制能力优于黄芩组；其中，黄连3组、黄连4组和黄连5组与对应黄芩组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其他黄连组与黄芩组的差异均无统计学意义(P>0.05)，见图1。

相同浓度条件下，黄连组与黄芩组比较，*P<0.05，**P<0.01with the same concentration, the comparison between coptidis rhizoma group and radix scutellariae group, *P<0.05, **P<0.01图1 黄连、黄芩水提物对鲍曼不动杆菌的抑制作用比较Fig 1 Comparison of inhibitory effect between the aqueous extract of coptidis rhizoma and radix scutellariae on Acinetobacter baumannii

3.2 不同浓度盐酸小檗碱、黄芩苷对鲍曼不动杆菌的抑制率比较

当药物浓度相同时，盐酸小檗碱组对鲍曼不动杆菌的抑制能力优于黄芩苷组;其中,盐酸小檗碱4组、盐酸小檗碱5组与对应黄芩苷组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其他盐酸小檗碱组与黄芩苷组的差异均无统计学意义(P>0.05)，见图2。

相同浓度条件下，盐酸小檗碱组与黄芩苷组比较，*P<0.05，**P<0.01with the same concentration, the comparison between berberine hydrochloride group and baicalin group, *P<0.05, **P<0.01图2 盐酸小檗碱、黄芩苷对鲍曼不动杆菌的抑制作用比较Fig 2 Comparison of inhibitory effect between berberine hydrochloride and baicalin on Acinetobacter baumannii

3.3 不同浓度黄连水提物联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制率比较

本研究中，生长对照组(CON组)鲍曼不动杆菌浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml。当替加环素浓度相同时，黄连与替加环素联合应用对鲍曼不动杆菌的抑制率略高于替加环素单用；当替加环素浓度为0.11 μmol/L时，黄连与替加环素联合应用的抑制率趋于替加环素单用(0.21 μmol/L)；但是，随着替加环素浓度增大，黄连与替加环素联合应用的抑制率与替加环素单用相比，差异越发不明显，见图3。

图3 黄连水提物联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制作用比较Fig 3 Comparison of inhibitory effect between the aqueous extract of coptidis rhizoma combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

3.4 不同浓度黄芩水提物联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制率比较

本研究中，CON组鲍曼不动杆菌浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml。当替加环素浓度相同时，黄芩与替加环素联合应用对鲍曼不动杆菌的抑制率略高于替加环素单用;当替加环素浓度为0.43 μmol/L时，黄芩与替加环素联合应用的抑制率略趋于替加环素单用(0.86 μmol/L)，见图4。

图4 黄芩水提物联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制作用比较Fig 4 Comparison of inhibitory effect between the aqueous extract of radix scutellariae combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

3.5 不同浓度盐酸小檗碱联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制率比较

本研究中，CON组鲍曼不动杆菌浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml。替加环素与盐酸小檗碱联合应用对鲍曼不动杆菌的抑制率随盐酸小檗碱浓度升高而升高;其中，替加环素浓度为0.11 μmol/L时的量效关系最明显，且随盐酸小檗碱浓度的升高，抑制率接近于高浓度替加环素组，见图5。

图5 盐酸小檗碱联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制作用比较Fig 5 Comparison of inhibitory effect between berberine hydrochloride combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

3.6 不同浓度黄芩苷联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制率比较

本研究中，CON组鲍曼不动杆菌浓度为(2.00～3.00)×105CFU/ml。当替加环素浓度相同时，黄芩苷与替加环素联合应用对鲍曼不动杆菌的抑制率略高于替加环素单用，抑制率随盐酸小檗碱浓度升高而升高，见图6。

图6 黄芩苷联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的抑制作用比较Fig 6 Comparison of inhibitory effect between Baicalin combined with tigecycline and tigecycline alone on Acinetobacter baumannii

4 讨论

4.1 黄连、黄芩对鲍曼不动杆菌的体外抑制作用

5个不同浓度的黄连、黄芩水提物干预鲍曼不动杆菌后，抑制作用随着药物浓度增加而增强，均无半抑制浓度，最高抑制率分别为20.21%、17.96%。高浓度黄连水提物对鲍曼不动杆菌的抑制作用显著优于黄芩水提物。本研究在观察黄芩水提物对鲍曼不动杆菌生长的影响时，发现低浓度黄芩水提物的菌浓度与CON组相比略有升高，推测这与黄芩的其他成分、水提时间有关。

4.2 盐酸小檗碱、黄芩苷对鲍曼不动杆菌的体外抑制作用

5个不同浓度的盐酸小檗碱、黄芩苷干预鲍曼不动杆菌后，抑制作用随着药物浓度增加而增强，均无半抑制浓度，最高抑制率分别为28.12%、25.57%。高浓度盐酸小檗碱对鲍曼不动杆菌的抑制作用显著优于黄芩苷。

4.3 黄连、黄芩水提物分别联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的体外抑制作用

替加环素对鲍曼不动杆菌的体外抑制能力显著强于黄连、黄芩水提物。替加环素浓度越高，联合用药的抑制率与替加环素单用相比越无显著差异。当替加环素浓度为0.11 μmol/L时，黄连水提物联合替加环素的抑制率趋于替加环素浓度为0.21 μmol/L时的抑制率；当替加环素浓度为0.43 μmol/L时，黄芩水提物联合替加环素的抑制率略趋于替加环素浓度为0.86 μmol/L时的抑制率。表明当替加环素处于低浓度时，黄连、黄芩水提物与替加环素联合应用可减少替加环素用量。

4.4 盐酸小檗碱、黄芩苷分别联合替加环素与替加环素单用对鲍曼不动杆菌的体外抑制作用

替加环素对鲍曼不动杆菌的体外抑制能力显著强于盐酸小檗碱、黄芩苷。替加环素浓度越高，联合用药的抑制率与替加环素单用相比越无明显差异。当替加环素浓度为0.11 μmol/L时，盐酸小檗碱联合替加环素的抑制率趋于替加环素浓度为0.21 μmol/L时的抑制率；当替加环素浓度为0.21 μmol/L时，黄芩苷联合替加环素的抑制率趋于替加环素浓度为0.43 μmol/L时的抑制率。推测当替加环素处于一定浓度时，盐酸小檗碱、黄芩苷与替加环素联合应用可考虑适度减少替加环素的用量。

4.5 黄连、黄芩、盐酸小檗碱及黄芩苷的作用机制

黄芩原药材对多种菌有体外抑制作用[11]；黄芩苷和黄芩素在临床抗炎治疗中应用广泛[12]。黄芩可在体外抗幽门螺杆菌[13]。黄浩等[14]的研究结果发现，黄芩苷对沙眼衣原体体外生长具有确切的抑制效应。马晓丽[15]的研究结果发现，黄芩苷与氟康唑联合应用治疗白念珠菌感染具有协同作用，且能增强白念珠菌对氟康唑的敏感度。周清[16]通过观察结核分枝杆菌被黄芩苷作用后，其细胞形态学发生的变化、菌体细胞膜与细胞壁受损的程度，认为黄芩苷可以破坏结核分枝杆菌的细胞膜和细胞壁结构，这可能是黄芩苷发挥抗菌作用的机制之一。

盐酸小檗碱是黄连最有效的活性成分之一。现代研究结果表明，黄连单用可抗大鼠胃溃疡炎症，且其主要成分盐酸小檗碱的抗炎活性最为显著[17]。盐酸小檗碱对痢疾杆菌、大肠杆菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、链球菌、伤寒杆菌及阿米巴原虫有抑制作用，且与西药联合亦有协同作用。盐酸小檗碱与亚胺培南联合使用时能有效提高两种药物各自对耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌的抗菌敏感性[18]；盐酸小檗碱与雷贝拉唑钠肠溶片联合使用可有效治疗幽门螺旋杆菌感染性胃溃疡疾病[19]。

盐酸小檗碱、黄芩苷在抑制鲍曼不动杆菌、优化抗菌药物应用等领域有着广阔的应用前景，其对鲍曼不动杆菌的作用机制还需进一步研究。