荧光探针分子探测硫化氢机理的理论研究

王晨阳　李福胜　管艳华　梁法库

摘    要：一直以来，荧光探针反应作为一种重要的反应机理被人们广泛关注。人们对荧光探针性质做了大量的试验，然而对荧光探针的理论计算关注度较低。对检测硫化氢的荧光探针的物理性质进行了详细的理论研究：首先，优化了4'-（二乙氨基）-3-羟基黄酮分子和探针分子的结构;之后，计算并分析了探针的频率以及吸收和发射光谱，理论上清晰地阐明探测硫化氢前后探针分子荧光行为和性质的改变;再次，还计算了探针分子的前线分子轨道，研究并分析探测过程中分子内的电子分布情况;最后，通过详细分析，很好地解释了荧光探针分子的探测机制，并验证了试验的准确性，为以后对该荧光探针的研究提供了帮助。并且得出结论：化合物A与2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反应生成探针分子，并与被探测物质硫化氢反应生成产物分子。

关键词：分子轨道理论;溶剂致变色;电子转移;密度泛函理论;激发态

中图分类号：O785+ .5             文献标识码：A             文章编号：2095-7394（2020）02-0081-06

荧光探针原理是利用探针分子与被探测物反应生成新的分子，通过检测生成的分子可以确定被探测物。荧光探针机理作为一种重要的反应机理，在生物、化学、物理等方面都发挥着重要的作用，被广泛应用于各个领域[1-5]。因此，荧光探针的检测反应机理一直以来都受到国内外专家的重点研究。[6-9]

硫化氢（H2S）是继一氧化氮和一氧化碳之后的第三种内源性有毒气体信号化合物（气体传输器），具有臭蛋味。人的身体可以产生少量硫化氢，硫化氢对身体有重要的作用，正常浓度的硫化氢对调节细胞氧化还原反应和其他反应起着至关重要的作用。研究已经证实，硫化氢不仅可以放松血管平滑肌，而且可以引起血管舒张并降低血压;硫化氢还是一种有效的抗炎颗粒;此外，硫化氢是一种有效的抗氧化剂，可以增加抗氧化剂含量。鉴于硫化氢有众多用途，研究硫化氢变得越来越重要。由于硫化氢本质具有不确定性，并且在大多数组织中含量较低，因此，如何以高灵敏度且不受其他生物硫醇的影响来检测硫化氢就很有研究意义。目前，有多种方法可用来检测硫化氢，例如比色法、电化学分析和气相色谱等[10-11]。在各种检测方法中，荧光检测是一种非常灵敏有效的方法。为了更好地检测硫化氢，在试验上设计合成了一种探针分子，由4'-（二乙氨基）-3-羟基黄酮分子（化合物A）与2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸分子反应生成。该探针分子具有良好的荧光特性，并且可以與硫化氢分子进行反应生成其他分子，从而很容易地通过改变的分子荧光特性检测到硫化氢分子，通过检测化合物A分子的荧光颜色和探针与硫化氢反应后生成物荧光颜色的改变来判断是否含有硫化氢，进而检测硫化氢的含量。在本次研究中，从理论上详细地分析了化合物A分子与硫化氢反应生成产物分子的荧光特性、检测前后分子结构的红外振动频率以及微观电子结构改变等物理性质。通过分子层面的理论分析，解释了探针分子检测硫化氢的探测机理，为试验上使用探针分子检测硫化氢的研究工作提供了重要的理论依据。

1   试验方法

为了计算出想要的数据，使用密度泛函和含时的密度泛函理论方法，并结合高斯函数劈裂基组进行计算[12]，所有的计算过程都在高斯16软件内完成[13]。充分地考虑了分子在弱相互作用下的结构、光谱以及频率等。通过使用自洽场反应，结合连续介质模型精确地对试验环境进行模拟，本文所有的计算分析都是在氯仿溶剂环境中进行的。选用泛函B3LYP[14]并结合基组6-311 g （d， p）对化合物A、探针分子和生成物分子进行优化，得到电子基态的分子结构。然后对分子进行红外振动光谱计算，得到的体系振动频率，不存在任何虚频，因此表明该基态结构稳定。随后优化了激发态的分子结构并计算了分子在激发态下的光谱。对于电子能量以及结构优化计算，均已考虑Grimme提出的DFT-D3[15]色散矫正。为了可以更加直观地看到分子在基态与激发态的电子密度分布是不同的，又使用视图软件将分子在基态下与激发态下的前线分子轨道绘制出来，通过观察电子云排布的不同，来判断分子的物理和化学性质[16-19]。

2   结果及讨论

2.1  化合物A分子与产物分子几何结构

基于含时密度泛函B3LYP/6-311g （d， p）的理论水平，在氯仿溶剂环境下充分地优化了分子几何结构。通过计算与优化，成功地优化出化合物A和探针分子的基态与激发态结构，同时，也优化出探针分子与硫化氢反应后生成的产物分子的基态与激发态结构。如图1所示，是探针分子探测硫化氢的反应机理。从图1中可以清楚地看到化合物A与2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反应生成探针分子，在加入硫化氢后，探针分子会与硫化氢分子进行反应，探针分子上的一个苯环会被一个氢原子所取代，生成一个新的分子，可以发现反应前后分子结构发生了明显的变化。通常情况下，探针分子与被探测物质发生化学反应，生成的产物分子可以呈现出不同的光物理以及光化学性质，通过对产物分子进行荧光光谱表征，实现对被探测物质的检测。

2.2  红外振动频率分析

为了确定优化出来的化合物A和探针分子的结构是正确的，在同样的理论水平B3LYP/6-311g （d， p）下计算了探针分子的振动频率。如图2所示：左图（a）（c）的谱线代表分子在基态结构时的振动频率;右图（b）（d）的谱线代表了激发态结构下的振动频率。在基态和激发态下，优化出来的结构都是没有虚频的，这说明优化出来的基态与激发态结构是最稳定的。通过观察振动频率谱图可以发现，分子在激发态时振动的幅度明显要比基态大得多，频率大小也整体左移变小。这说明频率在激发态下发生了红移，这会导致分子在激发态下更不稳定，进而更容易进行反应。然而，在基态和激发态下化合物A的振动频率均出现了位于3 500 cm-1附近的振动频率信号，这个峰值代表化合物A中羟基的伸缩振动，表明分子内存在很强的氢键相互作用。值得注意的是，通过纵向对比可以发现，探针分子的频率图谱中位于3 500 cm-1附近的特征峰消失了。这主要是因为化合物A与2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反应，取代了化合物分子中的羟基氢原子，破坏了分子内氢键相互作用，从而导致分子荧光性质的改变。在有机发色团中，组成分子的化学键或官能团的原子处于不断振动的状态，在理论研究中通过计算分子红外振动频率可以判断物质的成分，从而知道反应是否发生，是否有生成物生成等。对于实验工作者来说，如果事先通过理论计算分子结构的红外振动光谱，定性地预测试验中反应的可行性，那么就可以降低试验成本并提高工作效率。

2.3  光谱分析

为了能够得到探针分子的光谱数据，方便研究检测硫化氢分子的机理，使用密度泛函B3LYP/6-311g （d， p）的理论水平計算了化合物A的吸收能和荧光发射能。绘制探针分子的吸收发射光谱如图3（a）所示，得到的分子吸收光谱为424.47 nm，荧光发射光谱为475.69 nm和605.06 nm，发现光谱分别发生了51.22 nm、180.59 nm的斯托克斯位移;为了能够更好地证明反应的发生，我们又在同样的理论水平下计算了反应后产物分子的吸收与发射光谱，如图3（b）所示，得到的产物分子的吸收光谱为394.09 nm，荧光发射光谱为428.00 nm，发现光谱发生了33.91 nm的斯托克斯位移。其中G，S，S-T分别代表基态、激发态正常结构和激发态异构体结构光谱。反应前后光谱发生了明显的变化，荧光主要由化合物A的橙色变成了产物分子的蓝紫色。因此，可以发现探针分子在与硫化氢反应过后会生成新的分子，生成的分子的荧光特性与化合物A分子的荧光特性有主要的颜色差别，实现了对硫化氢的探测。因为反应前后的生成物和反应物有着不同的光学性质，所以它们的光谱波长也不同。

2.4  前线分子轨道分析

通过计算已经比较好地分析了分子的荧光特性及其反应方式。为了更清楚地研究分子的物理化学性质，并解释荧光探针分子的反应机制，本文通过视图软件计算化合物A分子和生成物分子在氯仿溶剂中的前线分子轨道，用来展示分子上反应前后电子云排布的差别和电子的转移特征。如图4所示，给出了分子的最高被占据的分子轨道（HOMO）与最低未被占据分子轨道（LUMO）。可以发现，分子在基态与激发态电子密度排布发生了很明显的变化，电子密度发生了明显的转移，电子云排布由HOMO轨道上的乙二胺及其连接的苯环向LUMO轨道上的稠环芳香烃萘移动。分子的电子云排布会直接影响分子物理化学性质，因此，分子在基态与激发态会有明显不同的光物理学现象。同时，化合物A与生成分子的明显不同，会影响他们的荧光性质。通过前线分子轨道等值面的分析可以更加直观地看到化合物A与产物分子在光诱导过程中电子结构的变化，展现出探针分子在探测硫化氢前后物理性质的改变，进而正确阐述荧光检测机制，最终对试验上观测到的荧光现象给予分子层面的解释和说明。

3   结论

本文研究了检测硫化氢的荧光探针机理及检测前后荧光性质的改变。首先，优化并分析了分子的几何结构，计算了这些结构的红外振动频率，发现优化的结构没有虚频，证明了优化的结构是准确的;然后，通过红外振动频率的分析，发现荧光探针分子在光激发过程中的振动频率发生明显的红移，表明探针分子在激发态上更容易与硫化氢发生反应，证实了产物分子的生成;接下来，为了重现试验上观测到的光物理现象，计算了分子的吸收和发射光谱，从计算的荧光光谱可知，在探测硫化氢前后分子的荧光颜色从橙色变成了蓝紫色，实现了对硫化氢物质的探测;最后，通过计算检测硫化氢前后的前线分子轨道等值面，从分子层面对荧光检测机制进行探究。可以得出以下结论：化合物A与2，2'-二吡啶二硫基苯甲酸反应生成探针分子，并与被探测物质硫化氢反应生成产物分子。通过与化合物A的前线分子轨道等值面相比，可以发现产物分子的电子结构发生明显变化，分子上的电子密度更多地从乙二胺及其连接的苯环部分向分子的稠环芳香烃萘的位置进行转移，从而影响了分子的荧光性质，导致在检测硫化氢前后分子的荧光颜色出现了明显的变化，最终实现对物质中硫化氢含量的检测。此研究很好地解释了荧光探针分子的探测机制，并验证了试验上的准确性，为后续对该荧光探针的研究提供了帮助。

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责任编辑    祁秀春

Theoretical Study on the Mechanism of Fluorescent Probes for Detecting

Hydrogen Sulfide

WANG Chenyang1，LI Fusheng2，GUAN Yanhua3，LIANG Faku4

（1. Physics Experiment Center，Qiqihaer University，Qiqihaer 161000，China;2. Keshan Xijian Center School，Qiqihaer 161000，China;3. Keshan County No. 2 Middle School，Qiqihaer 161000，China，4.School of Science，Qiqihaer University，Qiqihaer 161000）

Abstract： As an important reaction mechanism， fluorescent probe reaction has been widely concerned. People have done a lot of experiments on the properties of fluorescent probes，but they have paid less attention. The theoretical calculation of fluorescent probes can well simulate the mechanisms of probes，which provides theoretical support and improvement for experiments，and also makes important contributions to the research of fluorescent probes. In this article，we carried out detailed theoretical study of the physical properties of hydrogen sulfide fluorescent probe molecules. Firstly，the structures of 4'- （diethylamino） - 3-hydroxy flavone molecule and probe molecule are optimized. Secondly，we calculated and analyzed the infrared vibrational frequencies and absorption and emission spectra of the probe，the changes in the fluorescence behavior and properties of the probe molecules before and after the detection of hydrogen sulfide are researched in theory. At the same time，we calculated the front molecular orbitals of the probe molecules and studied the intra molecular distribution of electrons during the detecting process. Finally，through our detailed analysis，the detecting mechanisms of the fluorescent probe molecule is well explained，and the validity of experimental conclusion is verified，which provides help for the research of fluorescent probe in the future. Therefore，we concluded that the compound A reacted with 2，2'-dipyridine dithiobenzoic acid to form a probe molecule，and reacted with analyte to generate a product molecule.

Key  words： molecular orbitals theory;solvent induced discoloration;electron transfer;density functional theory;excited state

收稿日期：2019-11-03

基金項目：黑龙江省教育厅基本业务专项“一种新型静电动力机及热机的研制与应用”（135209251）

作者简介：王晨阳，高级实验师，主要研究方向为大学物理实验设计。