小麦育种中间材料抗病基因Lr34、Lr26、Yr26的分子标记检测

隋建枢，陈天青，王 伟，罗永露，刘 林，何庆才

(1.贵州省旱粮研究所, 贵阳 550006； 2.贵州大学生命科学院，贵阳 550025；3.贵州省农业科学院, 贵阳 550006)

小麦是贵州唯一的夏收粮食作物，解决贵州粮食生产中夏秋粮食空缺的问题发挥了重要作用。贵州省位于我国西南冬麦区，属于自给型雨养农业区，在小麦生长期内雨量较为充沛，气候温和湿润，易导致小麦病害的大发生。其中条锈病、白粉病是常发病，危害十分严重。近些年来，由于种植密度增大，水肥条件提高，使田间小气侯变得有利于小麦叶锈病的发生，叶锈病的危害有逐渐增大的趋势[1]。培育和推广抗病品种被公认为是防治小麦病害最经济、有效、安全的途径。

DNA分子标记是目前检测小麦抗病性状最为经济、高效的手段，它具有快速、准确、不受环境条件限制等优点。利用分子标记辅助选择，可以将许多优良的抗病基因聚集起来，克服传统育种的盲目性，加快育种进程，缩短育种周期。

张增艳等[2]利用小麦抗白粉病基因Pm4、Pm13、Pm21的特异PCR标记，对含有Pm4b、Pm13、Pm21的小麦品系复合杂交F2代40个植株进行检测，从中选择到Pm4b+Pm13+Pm21三个基因聚合的抗病植株11个，检测、选择到Pm4b+Pm13、Pm4b+Pm21、Pm13+Pm21两个基因聚合的抗病植株19个。任晓利等[3]通过构建抗叶锈基因Lr9-Lr26和Lr19-Lr20的复合PCR检测体系，对116个小麦品种(系)所含有的抗叶锈病基因进行了分子检测。杨亨等[4]采用Yr5，Yr9，Yr10，Yr18及Yr26的分子标记，对78份鉴定材料在2017—2018年国家冬小麦区试品种中可能含有的抗性基因进行检测，结果表明，78份鉴定材料中，可能携带Yr5，Yr9，Yr10，Yr18及Yr26的材料数分别为0，21，5，1份及9份。

本研究针对小麦抗条锈病的Yr26基因、抗叶锈病的Lr34、Lr26基因进行分子标记检测，期望从杂交小麦后代中筛选出同时含有2种或3种抗病基因的植株，为贵州小麦抗病育种提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 供试小麦

贵州省农业科学院旱粮研究所小麦课题组提供的小麦杂交后代F2～F4世代共337株。

1.2 引 物

Xgwm 18[5]、csLV 34[6]、IB-267[7]，由上海生工生物工程有限公司合成。见表1。

表1 引物信息及标记类型

1.3 DNA的提取

采取植株嫩叶，做好标记放入2 mL离心管中。用CTAB法提取基因组DNA[8]，用50μL去离子水溶解后保存在-20 ℃冰箱中备用。用超微量分光光度计检测DNA浓度，并用灭菌ddH2O将终浓度调至100 ng·μL-1，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4 PCR扩增检测

反应体系10μL，其中含有10×Buffer 1μL，2.5 mM dNTPsMixture 0.8μL，10μM上下游引物各0.7μL，100 ng·μL-1DNA 1μL，5 U·μL-1DNATaq聚合酶0.2μL，补ddH2O 5.6μL。PCR扩增反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 S，53～58 ℃(退火温度因引物而异)退火30 S，72 ℃延伸45 S，40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳银染检测。

2 结果与分析

2.1 分子标记的特异性检测

用引物IB-267对供试小麦材料进行PCR检测，结果见图1。扩增结果表明，337份小麦材料中有93份能扩增出210 bp的目标条带，可判断其含有抗叶锈病Lr26基因。用引物csLV 34 F/csLV 34 R对供试小麦材料进行PCR检测(图2)共检测出10份样品能扩增出150 bp的目标条带，可判断其含有抗叶锈病Lr34基因。用引物Xgwm 18对供试小麦材料进行PCR检测(图3)共检出137份样品能扩增出193/215 bp的目标条带，可判断其含有抗条锈病基因Yr26。

图1 部分供试小麦材料Lr26标记扩增结果

图2 部分供试小麦材料Lr34标记扩增结果

图3 部分供试小麦材料Yr26标记扩增结果

2.2 检测结果分析

从表2可以看出，在337份供试样品中，抗条锈病Yr26基因的检出率最高，为40.7%，抗叶锈病基因Lr26的检出率为27.6%，抗叶锈病基因Lr34的检出率较低，为3%。双基因的检出率分别为Yr26/Lr26为10.7%，Yr26/Lr34为0.6%，Lr34/Lr26为2.1%。而同时含有Lr34/Lr26/Yr26只有1份，检出率为0.3%。

表2 分子标记检测情况

综上所述，由于Lr34为抗叶锈病慢锈基因，在小麦抗病性植株选育中并没有得到充分的重视。Yr26是抗条锈病高抗基因，在没有专化毒性小种出现之前被长期广泛使用。检测结果中双基因与三基因检出率并不高，由此可见，分子标记技术更易帮助育种家在小麦杂交选育过程中聚合多个抗病基因，该技术的运用可为小麦抗病品种的选育提供有力的支持。

3 讨 论

1)小麦Yr26基因对除V 26菌系以外的所有条锈菌都具有良好抗性，在我国小麦条锈病育种中被广泛利用。虽然随着条锈菌新生理小种CYR 34的出现而丧失抗病性，但与其它抗条锈基因联合使用，可减少单一抗源品种抗病性丧失带来的危害。在本次供试样品中检出率较高，利用分子辅助标记可以实现该基因的大规模检测，可为小麦抗条锈病研究提供理论参考依据。

2)小麦Lr34基因属于多抗位点基因，由Krattinger等[9]于2009年克隆，该位点分别对应了Lr34(抗叶锈基因)、Yr18(抗条锈基因)、Sr57(抗杆锈基因)和Pm38(抗白粉基因)，是很好的抗叶锈病慢锈基因，至今仍未发现明显的小种专化性，但我国小麦育种材料中含Lr34抗叶锈病基因频率极低。本次研究的检出情况也印证了以往的报道。在高病害压力下Lr34单独存在时抗性还不够强，但与其他抗叶锈基因聚合时，则会表现出很强的抗性[10]。该基因位点与多种病害的抗性相关，在小麦抗病育种中应该加强利用，充分发掘其抗病价值。

3)小麦抗叶锈病基因Lr26位于1 BL/1 RS易位系上，是我国20世纪80年代的主要抗源，曾被育种家广泛使用。虽然目前Lr26单独使用已经丧失抗性，但与其他抗病基因组合使用时，仍然具有很好的抗病效果。