18份银合欢种质萌发期耐盐性综合评价

严琳玲，张 瑜，王文强，郇恒福，虞道耿

(中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所/农业部华南作物基因资源与种质创制重点实验室，海南 儋州 571737)

银合欢(LeucaenaBenth.)是豆科重要的热带牧草之一，多年生灌木或乔木，原产美洲，现广泛分布于世界热带亚热带地区[1]。由于营养丰富，干物质中粗蛋白质含量可达 21%～29%[2]，被誉为“奇迹树”，“蛋白仓库”[3]，常被用作青饲、干饲、青贮和放牧家畜[4]。银合欢具有生长快、耐刈割、固氮等特点，可作为绿肥作物间作于幼龄胶园[5]。银合欢叶还可用于蘑菇、香菇等食用菌的栽培基质，并已有试验证明其可行性[6]。

盐胁迫会造成种子发芽慢、种苗生长畸形，从而导致减产，严重影响了农业生产[7]，因此，在生产中，盐渍土被认为是农业生产中的一种低产土壤类型[8]。我国盐渍土约占耕地面积的 10%[9]。近年来，随着工业发展、人口增长和环境恶化等，土壤盐碱化和次生盐碱化面积不断增加[10]。因此，改良和利用盐渍土地已成为当前的研究热点之一[11]。目前，筛选耐盐新品种被广泛认为是改良利用盐渍土的重要途径之一[12]。

本研究在对银合欢种质资源进行引进调查的基础上，进一步评价银合欢种质的育种价值，对18份种质进行芽期耐盐评价，筛选芽期耐盐银合欢种质，为研究银合欢耐盐机制及选育耐盐品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料共18份，均从美国夏威夷大学引入并种植于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草研究室基地。本试验所用种子为2012年采集。

1.2 试验方法

选择籽粒饱满、无病虫害且大小均一的健康种子30粒，用70%酒精消毒30～60 s，蒸馏水冲洗干净置于培养皿中，以双层滤纸为发芽床。用0.4%、0.8%、1.2% NaCl溶液10 mL模拟盐胁迫处理，对照加入等量的蒸馏水，每处理重复3次，置于光照培养箱，培养温度为25 ℃，光照8 h，18 ℃，黑暗16 h。

1.3 指标测定

从种子置床之日起开始观察，以种子露白为发芽的开始，参照《种子检验学》进行相关数据的测定[8]，每天定时记录每个培养皿内种子萌发数，萌发结束(萌发后期连续3 d无萌发种子)后，随机抽取5株幼苗，测定根、芽的长度以及幼苗的鲜重。胚芽、胚根长度用游标卡尺测量，幼苗鲜重用万分之一天平称量。

1.4 数据处理

为了减少各材料间固有的差异，采用性状相对值进行耐盐性的综合评价。数据使用相对发芽率、相对发芽势、相对胚根长、相对胚芽长、相对胚根重、相对胚芽重。采用SPSS 18.0软件对相对值进行统计分析，用单因素方差分析法进行方差显著性分析。

1.5 耐盐性综合评价

计算各指标的耐盐指数[13]，并利用耐盐指数进行隶属函数综合评价其芽期耐盐性。

耐盐指数=3个盐浓度下测定值的相对值

在进行耐盐隶属函数值计算时，需利用以下公式进行标准化处理：

(1)

式中，Xj表示第j个指标值，Xmin表示第j个指标的最小值，Xmax表示第j个指标的最大值。

采用标准差系数法(S)，用公式(2)计算标准差系数Vj，公式(3)归一化后得到各指标的权重系数Wj，公式(4)计算隶属函数值D，隶属函数值越大，表示银合欢种质在盐胁迫下耐受力越强。

(2)

(3)

(4)

2 结果与分析

2.1 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对发芽率的影响

在不同盐浓度的处理下，随着盐浓度的升高，除L 01、L 05外，16份银合欢种质的相对发芽率均发生显著性变化(p<0.05)，其中，L 02、L 03、L 06、L 07、L 08、L 09、L 10、L 11、L 12、L 13、L 15、L 16银合欢种质的相对发芽率随着盐浓度的升高而降低；L 04、L 18银合欢种质相对发芽率呈先降后增趋势；L 14银合欢种质相对发芽率呈先增后降趋势。在盐浓度为0.4%时，有8份银合欢种质的相对发芽率高于100%，说明其发芽率优于对照，表现良好；当盐浓度为0.8%时，仅L 02、L 06的相对发芽率高于100%；当盐浓度为1.2%时，仅L 01、L 02的相对发芽率高于100%，说明L 02表现出对盐较强的适应性。

对同一盐浓度下的各银合欢种质的平均相对发芽率和变异系数进行分析可知，随着盐浓度的增加，平均相对发芽率呈下降趋势，变异系数呈增加趋势，且当盐浓度达1.2%时，变异系数为21.3%，说明高盐浓度下银合欢种质间的相对发芽率差异较大，表现出对高盐耐受力的不一致。

2.2 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对发芽势的影响

在不同浓度盐胁迫下，L 02、L 04、L 06、L 07、L 08、L 09、L 10、L 11、L 13共9份银合欢种质均随着盐浓度的升高，相对发芽势不同程度的降低，其中L 04、L 06、L 07、L 09、L 11、L 13相对发芽势间的差异显著(p<0.05)。同一浓度下银合欢种质的相对发芽势间差异达极显著(p<0.01)，且从变异系数可看出，随盐浓度增加，变异系数呈增加趋势，当盐浓度在0.4%及0.8%时，变异系数相差不大，分别为6.97%、18.74%，但当盐浓度为1.2%时，变异系数达48.46%，说明在盐浓度下各银合欢种质间的相对发芽势差异较大，表现出对高盐适应性的不一致。在18份种质中，L 02在3个盐浓度下相对发芽势均高于100%；L 06、L 07、L 08在盐浓度为0.4%和0.8%时，相对发芽势高于100%；L 04、L 10在盐浓度为0.4%时，相对发芽势高于100%。

2.3 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对胚根长的影响

由表2可看出，L 03、L 05、L 07、L 09、L 11、L 14、L 17、L 18共8份银合欢种质随盐浓度上升，相对胚根长逐渐下降。方差分析表明，不同的盐浓度处理对18份银合欢种质间的相对胚根长均有极显著差异(p<0.01)。对同一浓度下各银合欢种质间相对胚根长的变异系数可知，不同盐浓度间相对胚根长变异系数变化范围不大，为16.61%～26.35%，当盐浓度为1.2%时，其变异系数最大(26.35%)，说明低盐较高盐对种质间相对胚根长的影响小。18份银合欢种质中，在盐浓度为0.4%时，除L 08、L 13、L 16、L 18外，其余14份银合欢种质的相对胚根长大于100%，说明低盐浓度下，14份银合欢种质的胚根长优于对照，有利于胚根生长；在盐浓度为0.8%时，仅L 01、L 02、L 05、L 06、L 07、L 12、L 14、L 15、L 17共9份种质相对胚根长大于100%；当盐浓度为1.2%时，仅L 01、L 02、L 06、L 07、L 12、L 15、L 17共7份种质相对胚根长大于100%。

表2 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对胚根长和相对胚芽长的影响

2.4 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对胚芽长的影响

除L 01、L 03、L 10、L 12、L 14、L 15、L 16外，其余11份银合欢种质相对胚芽长在不同盐浓度下差异显著(p<0.05)，同一盐浓度下各银合欢种质间的相对胚芽长差异达极显著(p<0.01)，并且变异系数随着盐浓度的增加而增加，但变化范围不大，在14.37%～16.93%。除L 01、L 03、L 05、L 10、L 12、L 13、L 18外，其余11份银合欢种质的相对胚芽长均随着盐浓度的增加而降低。

2.5 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对幼苗苗重的影响

由表3可看出，L 01、L 02、L 03、L 04、L 12、L 14、L 15、L 16共8份银合欢种质随盐浓度上升，幼苗相对苗重逐渐下降。方差分析表明，不同的盐浓度处理对18份银合欢种质间的相对苗重均有极显著差异(p<0.01)。对同一浓度下各银合欢种质间相对胚根长的变异系数可知，不同盐浓度间相对胚根长变异系数变化范围不大，为15.40%～31.20%，当盐浓度为1.2%时，其变异系数最大(31.20%)，说明低盐较高盐对种质间相对苗重的影响小。18份银合欢种质中，在盐浓度为0.4%和0.8%时，除L 09、L 12、L 13、L 14、L 15、L 16外，其余12份银合欢种质的相对苗重大于100%，说明低中盐浓度下，12份银合欢种质的相对苗重优于对照，有利于植株生长；当盐浓度为1.2%时，仅L 02～L 08、L 10、L 11、L 17、L 18共11份种质相对苗重大于100%。

表3 不同浓度NaCl胁迫对银合欢种子相对苗重的影响

2.6 银合欢种质耐盐指标的相关性分析

对盐胁迫下银合欢种质的5个性状的相对值进行了相关性分析，其中，发芽率与发芽势间的相关性最高，相关系数为0.918，发芽势与幼苗鲜重、胚根长与胚芽长呈极显著的正相关，相关系数分别为0.841和0.872；发芽率与鲜重、发芽率与胚芽长之间的相关性也较高，相关系数为0.77和0.545。

2.7 银合欢种质的模糊隶属函数耐盐性综合评价

采用模糊数学隶属函数法对银合欢种质盐胁迫的耐受性进行综合评价。隶属值越大，耐盐性越强。由表5可看出，18份银合欢种质的综合评价值介于0.12～0.92，其中综合评价值大于0.8的种质有2份，即L 02、L 07，表明其具有极强的耐盐能力；其次为L 06、L 17、L 01、L 04、L 03、L 05、L 08，综合评价值大于0.5；综合评价值小于0.3的材料有2份，即L 13、L 16，耐盐能力较弱，7份材料的综合评价值介于0.3～0.5之间，耐盐性居中。

表4 NaCl胁迫下银合欢种质幼苗生长指标的相关系数

表5 盐胁迫下银合欢种质各生长指标相对值的隶属值

2.8 银合欢种质的耐盐性聚类分析

基于欧氏距离、采用可变类平均法对16份银合欢种质的耐盐性进行聚类分析，由图1可看出，在欧氏距离>5时，16份银合欢被分为三类：第Ⅰ类包括L 05、L 08、L 03、L 04、L 01、L 11、L 18、L 10、L 14、L 06、L 17，这类种质耐盐性排序均位于中间，属于中等耐盐种质；第Ⅱ类包括L 12、L 15、L 13、L 09、L 16，这类种质耐盐性排序前5位，可初步认定此类种质为盐敏感种质；第Ⅲ类包括L 02和L 07，此类种质耐盐排序在最前，可认定为高耐盐种质。

图1 银合欢种质萌芽期耐盐性的聚类分析

3 讨 论

耐盐鉴定是牧草新品种选育的重要内容之一，而植物在芽期及幼苗期对盐分胁迫反应较为敏感[14]。因此，植物盐胁迫的试验阶段主要集中在苗期及萌芽期，苗期试验主要为大田、盆栽及水培试验。大田试验虽然最接近于植物的自然生长情况，但却易受到天气的影响，且评价时间长，费时费力[15]；盆栽和水培法虽然不受天气的影响，但需要在特定的环境下进行，成本高[16,17]；而萌芽期进行盐胁迫试验既可以一次性评价大量种质，又有较强的可操作性和可控性[18-21]，且发芽时间短、花费小。研究表明，芽期是研究作物耐盐强弱重要时期之一[22-23]，且其评价结果与苗期有一定的一致性[24]。因此，萌芽期的耐盐性评价有利于加速耐盐品种的选育[25]。

研究表明，萌芽期对盐浓度的响应最为敏感[26-31]，芽期对盐浓度的耐受力会直接影响苗期的生长发育，且其耐盐性评价多从种子萌发指数(发芽率、发芽势)和生长指数(胚根长、胚芽长、苗重)进行综合分析，但由于品种的差异导致其对盐胁迫的响应存在一定差异。有研究认为，随着盐浓度的增加，发芽率、发芽势均随之降低，且差异显著[29,30,32-34]，而胚芽和胚根长、苗重则会出现降低[32]或先增后降[29,35]2种趋势。本研究结果表明，随盐胁迫强度增加，部分银合欢种质在低盐浓度下相对发芽率、相对发芽势呈上升趋势，但在高盐浓度下却呈下降趋势，这也说明低盐对部分银合欢种子萌发具有一定促进作用；但其胚根长、胚芽长则表现出不规则的变化，部分银合欢种质在盐胁迫下胚根长、胚芽长显著增加，部分银合欢种质则表现显著降低。

牧草的抗逆性综合评价方法很多[36]。由于植物对盐胁迫的相应是个极其复杂的过程，为了避免片面性，在盐胁迫评价时多采用多指标综合评价[37]。本研究以相对发芽率、相对发芽势、相对胚根长、相对胚芽长、相对苗鲜重为指标，以不同盐浓度各指标的隶属函数值均值为依据，通过聚类分析将18份银合欢种质的耐盐性划分三类：耐盐种质L 02和L 07；中等耐盐种质L 05、L 08、L 03、L 04、L 01、L 11、L 18、L 10、L 14、L 06、L 17；盐敏感种质L 12、L 15、L 13、L 09、L 16。

通过对引进的银合欢种质芽期耐盐性的鉴定可以为选育耐盐性强的银合欢品种提供种质材料，进而满足当前对盐碱地种植草种的需求。但本试验仅从芽期探讨了银合欢的抗旱性，还需要在幼苗期进一步验证，以便更准确地筛选出耐盐银合欢种质。