0.01%硫酸阿托品滴眼液对实验动物眼部的安全性评价研究△

肖云峰盛惟刘剑（.内蒙古医科大学新药安全评价研究中心呼和浩特000；2.内蒙古盛唐国际蒙医药研究院有限公司 呼和浩特 00000；3.包头朝聚眼科医院 包头 04060）

包头朝聚眼科医院在内蒙古自治区包头市开展了为期80余天的青少年眼健康筛查工作。经过调研发现小学生近视发病率达24.76%，初中生近视发病率达50.7%，高中生近视发病率达55.87%[1]。

当今世界青少年越来越不注重用眼卫生，加之日常生活中的电脑、手机使青少年用眼负荷过早增大，导致近视眼成为发病率最高的眼病之一[2-5]。如何预防和治疗青少年近视成为医学界关注的焦点[6，7]。1%硫酸阿托品扩瞳作用强，扩瞳后恢复较慢，一般患者不愿长时间使用。0.01%硫酸阿托品滴眼液阿托品含量适中，对睫状肌麻痹作用弱，视近物不模糊，且对瞳孔无散大，对青少年近视有一定的恢复作用[8-10]。本研究为促进临床安全使用0.01%硫酸阿托品滴眼液提供一定的理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物：Wistar大鼠，体质量180～220 g，清洁级，由内蒙古医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号：SCXK（蒙）2015-0001。新西兰大耳白兔，体质量1.7～2.1 kg，普通级，由内蒙古医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证编号：SCXK（蒙）2015-0001。

1.2 受试药物及主要试剂：0.01%硫酸阿托品滴眼液（包头朝聚眼科医院，批号20190909）；0.05%硫酸阿托品注射液（天津药业集团新郑股份有限公司，批号201904081）；0.9%氯化钠注射液（贵州科伦药业有限公司，批号E118052804）；无水乙醚（天津市富宇精细化工有限公司，批号20190627）；大鼠丙二醛（MDA）ELISA检测试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批号20190901003）；大鼠总超氧化物歧化酶（T-SOD）ELISA检测试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批号20190901008）；大鼠谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）ELISA检测试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批号20191009005）；大鼠过氧化氢酶（CAT）ELISA检测试剂盒（泉州市睿信生物科技有限公司，批号20191008008）；荧光素钠（上海源叶生物科技有限公司，批号L03A10H94500）；硫化钠（NaS）（天津永晟精细化工有限公司，批号 20180530）。

1.3 实验仪器：电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，型号BS2202S）；低温冷冻离心机（美国SIGMA公司，型号3K15）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司，型号CICI-PI-150FEL）；实体解剖显微镜（德国Leica公司，型号DFC 290）；全自动酶标仪（美国 Thermo Fisher公司，型号 Multiskan MK3）；schiotz眼压计（苏州六六视觉科技股份有限公司，型号YZ7A）；裂隙灯显微镜（苏州六六视觉科技股份有限公司，型号YZ5G）；微量移液器（美国Thermo Fisher公司，型号F2）；摄像机（日本索尼公司，型号HDR-PJ820E）。

2 实验方法

2.1 视网膜光线异常敏感试验

2.1.1 实验动物及分组：选取健康Wistar大鼠60只，雌雄各半。适应性饲养7 d后，按性别、体重将大鼠随机分为空白对照组（0.9%氯化钠注射剂）、供试品组（0.01%硫酸阿托品滴眼剂）和对照高剂量组（0.05%硫酸阿托品注射剂），共3组，每组20只，雌雄各半。

2.1.2 强光损伤视网膜模型的建立：强光损伤视网膜的模型采用手术联合光照箱法建立。在光照箱的六个面分别安装4根15W的白色LED灯管（Philips），光照箱上方安装通风孔，光照箱下方为密集的通风孔，光照箱内安放两个体积为48 cm×24 cm×25 cm有机玻璃透明箱。大鼠正常活动时，大鼠眼球水平的各箱壁照度均大于2740 lux，光照箱内的平均温度控制在18℃～24℃，换气次数≥15次/h。模型建立前的所有大鼠在每天12 h明（20～50 lux）以及12 h暗（0～12 lux）的循环光环境下适应10 d。第11天，将大鼠逐只放入玻璃乙醚麻醉缸中麻醉，麻醉后的大鼠使用角针和4#不可吸收缝合线在其眼睑中部与鼻侧皮肤处缝一针，使其无法闭眼。待大鼠清醒后逐只将其放入光照箱，持续接受照度大于2740 lux的光照射3 h。3 h光照后拆除眼睑缝合线，将大鼠送回正常环境中。

2.1.3 给药及取材：模型建立后对3组大鼠进行给药。空白对照组大鼠每眼给予0.9%氯化钠注射剂0.05 mL，供试品组大鼠每眼给予0.01%硫酸阿托品滴眼剂0.05 mL，对照高剂量组大鼠每眼给予0.05%硫酸阿托品注射剂0.04 mL，开合眼睑使受试物与大鼠眼球充分接触。给药24 h后，将大鼠进行乙醚麻醉，股动脉放血处死。迅速小心摘取大鼠双侧眼球，于实体解剖显微镜下，用眼科镊夹住视神经侧，使用锋利的刀片划开角膜，沿锯齿缘剪掉角膜。将眼球放入生理盐水，小心剥离视网膜与眼球后壁，摘下视网膜，用滤纸吸去视网膜表面液体。将双侧视网膜，放入1 mL生理盐水，充分研磨制成匀浆，-4℃3 500 r/min离心10 min，取上清液，冷冻分装。按照ELISA检测试剂盒操作说明，测定视网膜中MDA、T-SOD、GSH-PX 和CAT含量。

2.2 眼压检测试验

2.2.1 实验动物及分组：选取健康新西兰大耳白兔9只，雄性。家兔适应性饲养7 d后，按体重将兔随机分为空白对照组（0.9%氯化钠注射剂）、供试品组（0.01%硫酸阿托品滴眼剂）和对照高剂量组（0.05%硫酸阿托品注射剂），共3组，每组3只。

2.2.2 给药及数据采集：试验采用同体左右侧自身对比法，空白对照组家兔左眼给予0.9%氯化钠注射剂0.1 mL，供试品组家兔左眼给予0.01%硫酸阿托品滴眼剂0.1 mL，对照高剂量组家兔左眼给予0.05%硫酸阿托品注射剂0.08 mL，家兔右眼均不做处理。受试物滴入后，开合眼睑使其与家兔眼球充分接触，保证药物充分暴露。在给药后 1、2、4、24、48 和 72 h，使用 schiotz眼压计测定家兔双侧眼压并记录。

2.3 急性眼刺激性试验

2.3.1 实验动物及分组：选取健康新西兰大耳白家兔15只，雄性，适应性饲养7 d，适应性期间对动物进行体重测定和临床症状观察。给药前24 h用带磨钝的8号注射针头的注射器在兔两侧眼下穹窿部结膜处滴入2滴无菌的2%荧光素钠溶液，1～2 min后观察，黄绿色的染色可显示角膜上皮缺损的部位及范围，同时，使用裂隙灯对家兔双眼结膜损伤情况进行检查，剔除眼睛刺激症状、角膜缺陷和结膜损伤的兔后，留取9只。按体重将这9只兔随机分为空白对照组（0.9%氯化钠注射剂）、供试品组（0.01%硫酸阿托品滴眼剂）和对照高剂量组（0.05%硫酸阿托品注射剂），共3组，每组3只。

2.3.2 试验方法及评价：采用同体左右侧自身对比法进行实验。24 h内滴眼给药4次（间隔8 h），空白对照组家兔左眼结膜囊给予0.9%氯化钠注射剂0.1 mL，供试品组家兔左眼结膜囊给予0.01%硫酸阿托品滴眼剂0.1 mL、对照高剂量组家兔左眼结膜囊给予0.05%硫酸阿托品注射剂0.08 mL，滴入后开合眼睑使受试物与兔眼球充分接触，保证药物充分暴露，右眼不做处理。最后一次给药后 1、2、4、24、48、72 h，再次对家兔进行眼刺激反应情况检查。连续观察21 d，每天对家兔双眼进行检查，每次检查都详细记录兔眼部异常反应，根据眼刺激反应分值标准计算眼刺激反应分值，判断眼刺激程度。

3 实验结果

3.1 视网膜光线异常敏感试验：各受试物组大鼠视网膜中MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT的含量进行组间比较，均无显著差异（P>0.05）。结果表明，0.01%硫酸阿托品对视网膜光线异常敏感试验模型大鼠视网膜中MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT含量无影响。结果见表3。

表3 受试物对视网膜光线异常敏感试验模型大鼠视网膜中MDA、TSOD、GSH-PX 和 CAT 含量的影响（±s，n=20）Tab.3 Effects of the test substance on the retinal light abnormality test model rats MDA，T-SOD，GSH-PX and CAT contents（±s，n=20）

表3 受试物对视网膜光线异常敏感试验模型大鼠视网膜中MDA、TSOD、GSH-PX 和 CAT 含量的影响（±s，n=20）Tab.3 Effects of the test substance on the retinal light abnormality test model rats MDA，T-SOD，GSH-PX and CAT contents（±s，n=20）

组别 M D A（m m o l/g p r o t）T-S O D（U/m g H b）G S H-P X（U/m g p r o t）C A T（U/m g p r o t）空白对照组供试品组对照高剂量组1 0 9.3 6±5.9 6 1 1 4.8 6±8.2 3 1 0 6.1 8±1 1.1 2 3 3 5.1 3±2 9.1 0 2 9 6.0 1±2 3.1 7 3 1 8.7 7±3 1.2 8 6 4 3.9 9±6 6.8 1 6 7 3.4 5±4 1.5 9 6 7 7.7 4±3 4.6 9 1 5 2 6.5 1±1 2 7.7 8 1 5 1 9.0 1±1 1 6.0 4 1 5 2 8.5 5±1 3 5.5 1

3.2 眼压检测试验：结果显示，所测得给药后家兔眼压均在家兔眼压正常值范围内。结果表明，受试物对家兔眼压无影响。结果见表4。

表1 眼刺激反应分值标准Tab.1 Eye irritation response score criteria

表2 眼刺激性评价标准Table 2 Evaluation criteria for eye irritation

表4 受试物对家兔眼压的影响Table 4 Effects of test substances on intraocular pressure in rabbits

3.3 急性眼刺激性试验：根据表3、表4，对家兔给药期间及观察期观察显示，受试物对家兔眼角膜、结膜、虹膜均未造成损伤，眼部未发生水肿反应，同时，眼部也并未因给药而出现分泌物增多、分泌物黏稠等症状，结果表明，受试物未对家兔眼部给药部位产生刺激性。

4 讨论

0.01%硫酸阿托品滴眼液对视网膜光线异常敏感试验模型大鼠视网膜中的MDA、T-SOD、GSH-PX和CAT等内源性物质的含量无影响；0.01%硫酸阿托品滴眼液滴眼给药后对家兔眼压无影响；0.01%硫酸阿托品滴眼液对家兔眼部不产生刺激性，不损伤家兔眼部角膜、结膜、虹膜等组织器官，不会诱发家兔眼部水肿反应。