MicroRNA27a抑制肝星状细胞脂质代谢分子机制的初步研究

徐梓馨 罗昕 罗声政 徐铭益 林仁坤

非酒精性脂肪性肝病(nonalchoholic fatty liver disease,NAFLD)是以脂肪在肝脏异位沉积为特征的一组临床病理综合征[1-2]。近年随着生活水平的提高和饮食习惯的改变， NAFLD 的患病率不断提高，但是对于NAFLD 发病机制的研究尚不完全清楚，治疗选择有限[3-5]。microRNA(miRNA)是一类高度保守的组织特异性小非蛋白质编码RNA，在细胞生长、分化和死亡等过程中起重要作用，其表达失调会引起疾病[6-7]。miRNA已被证明在啮齿动物和人类肝病中具有预后和预测价值[8-10]。文献报道miR-27、miR141、miR-212-5p、miR-122、miR-34a和miR-16等在慢性肝病中发挥重要作用[12-16]。研究发现，miR-27参与调节脂肪细胞和巨噬细胞中的脂质代谢，并与动脉粥样硬化的发生发展有关[17]。

研究表明，转分化(或“激活”)的肝星状细胞是分泌基质蛋白的成肌纤维细胞的主要细胞来源，是肝纤维化的主要驱动力[18]。本研究通过观察过表达 miR -27a 之后肝星状细胞脂质沉积变化和相关脂质代谢蛋白的表达水平，以及脂肪肝模型小鼠 miR -27a 表达水平和相关脂质代谢蛋白水平的变化，探讨肝星状细胞中 miR -27a 表达水平与肝脂肪变的关系。

资料与方法

一、材料与试剂

实验小鼠购于中国科学院上海实验动物中心，LX2细胞保存于上海市第一人民医院临床转化院实验室，DMEM培养基、胎牛血清购自美国 Hyclone公司、0.25%的胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ均购自上海曜登生物科技有限公司，LipofectamineTM2000 脂质体转染试剂盒、磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)购自上海碧云天生物技术有限公司；Trizol试剂购 自 美 国 Invitrogen公司，反转录试剂盒购自日本 TaKaRa公司，SYBR GreenPCR 试剂盒购自美国 ApplideBiosystem公司，PCR引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，HE、天狼星红染色试剂购于上海萌桠生物科技有限公司。

二、方法

(一)实验动物 健康雄性C57BL/6小鼠10只，SPF级，约 4周龄，体质量 12～15 g，由中国科学院上海实验动物中心提供，饲养于上海交通大学附属第一人民医院实验动物中心，自由饮水，温度湿度符合标准，实验小鼠随机分为普通饮食加CCL4组、高脂加CCL4组，每组各5只，均腹腔注射CCL4,分别给予普通饲料，高脂饲料喂养，喂养至8周处死，部分肝组织放于14% 甲醛溶液中，石蜡包埋组织学染色；同时留取少量组织存放于-80℃冰箱用于后续PCR。

(二)细胞培养 采用含10%FBS的DMEM培养基培养人星状细胞，置于 37℃、体积分数为0.05的CO2培养箱中进行培养。加入 0.25% 的胰蛋白酶消化细胞，并进行传代。传代时，将细胞悬液均匀地分配至细胞培养皿中，完全培养基补充至每皿 6 mL，继续培养，根据需要收集细胞,用于PCR、油红染色实验。

(三)肝脏组织病理检查 肝组织固定48 h后，常规脱水、透明和石蜡包埋。以4 μm厚度进行石蜡组织切片， HE和天狼猩红染色，光学显微镜下检测其病理程度并拍照。

(四)过表达 miR-27a的LX2细胞建立 取生长状态良好的LX2细胞接种于6孔板中，每孔加入 2×105个细胞，当细胞融合度达到80%左右时，使用 LipofectamineTM2000转染试剂盒进行转染， 瞬时转染按照说明书进行。设置空白对照组、过表达组(miR-27a)，转染浓度为50 nmol/mL 的miR27a mimics，转染48 h；

(五)qRT-PCR 法检测 miR-27a、FAS、SCD1相对表达量 按照试剂说明书采用TRIzol法提取总RNA并纯化, 利用 Nanodrop 系统测定 RNA 样品的浓度和纯度，检测 260 nm 和 280 nm 下吸光度(A)值，判断样品纯度是否符合实验要求。测定RNA浓度。反转录合成cDNA后行RT-PCR。RT-PCR引物序列见表1。实验过程中以U6 、β-actin分别作为miRNA-27a、FAS、SCD1 的内参对照, 进行标准化转换得到各样本的拷贝数(Ct 值), 样品目的基因的相对表达率(Relative expression，RQ)采用 △△CT 方法计算，RQ=2-△△CT。每个样品的内参基因和靶基因各设3个重复试验。

表1 qRT-PCR相关引物序列

(七)油红染色检测脂质沉积程度 弃掉培养液，用PBS轻缓清洗3次，加入10%多聚甲醛固定30 min后，按照储备液：稀释液=5：2的比例配制染色液，配好后用慢速滤纸滤过，染色10 min，染液体积覆盖住孔板即可，用60%异丙醇漂洗，除去多余染料，保持背景色干净，复染12 s，封片，镜检。

三、统计学分析

正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用 SPSS16.0 统计软件分析。两组间比较采用独立样本t检验，3组间采用方差分析，偏态分布时采用非参数检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、小鼠肝组织病理检查

HE染色结果显示普通饮食加CCL4组肝小叶结构不完整，中央静脉周围肝细胞索排列紊乱，汇管区可见有炎性细胞浸润,部分肝细胞点状坏死。高脂加CCL4组肝组织可见肝小叶结构不完整，中央静脉周围肝细胞索明显紊乱,汇管区肝细胞片状坏死，同时可见中央静脉周围肝细胞脂肪变性，出现大量大小不等的脂滴泡。天狼星红染色显示，普通饮食加CCL4组和高脂加CCL4组均有纤维增生，可见明显染色成红色的纤维间隔，如图1。

图1 各组小鼠肝组织光镜下表现 A、B：HE染色(×100)；C、D：天狼星红染色结果(×100)

二、miR-27a在高脂加CCL4组小鼠肝组织中表达下降

在高脂加CCL4组小鼠肝组织中，miR-27a相对表达水平为(0.230±0.001,P=0.02)，普通饮食加CCL4组小鼠肝组织中miR-27a相对表达水平为(1.00±0.0021)，高脂加CCL4组miR-27a表达明显下降，说明在CCL4诱导肝纤维化的情况下，高脂诱导肝脏脂肪变时miR-27a表达水平也会下降。

三、高脂加CCL4组小鼠肝脏组织中FAS、SCD1相关mRNA表达上升：

FAS、SCD1均为促进脂肪酸合成的关键酶。普通饮食加CCL4组FAS与SCD1分别为(1.00±0.016)、(1.00±0.032)，高脂加CCL4组小鼠肝组织中FAS、SCD1相关的mRNA表达量明显增高，分别为(2.23±0.24)，P=0.0267，(1.98±0.17)，P=0.011；说明在高脂喂养的情况下，FAS、SCD1的表达可增强，提示脂肪酸合成增强。

四、PA刺激后LX2细胞中miR-27a表达下降

对照组miR-27a表达为(1.00±0.131), 200 μmol/L、400 μmol/L PA刺激LX2细胞后miR-27a 的相对表达量为分别为(0.333±0.003，P=0.0024)和(0.413±0.005，P=0.001)，PA刺激常用来诱导细胞脂肪变性，提示在脂肪变性的LX2细胞中miR-27a的表达可能受到抑制。

五、过表达miR-27a后LX2细胞脂质沉积减轻

空白对照组细胞轮廓稍变圆，细胞内可见散在红色脂滴分布，位于细胞膜内侧边缘。在过表达miR-27a后48 h，LX2细胞内鲜见脂滴，胞内可见细胞核，边缘清晰。如图2。

图2 空白对照组(A)和miRNA-27a过表达组(B)油红染色(×200)

六、在过表达miR-27a后LX2细胞FAS、SCD1的mRNA表达下降

对照组FAS、SCD1相关mRNA表达量分别为(1.00±0.085)和(1.00±0.034) ，miR-27a过表达组中FAS、SCD1相关mRNA表达量分别为(0.21±0.001)和(0.35±0.005)，与对照组比较，差异有统计学意义(均P<0.05)，说明miR-27a过表达可能抑制FAS、SCD1的表达，FAS、SCD1均为促进脂肪酸合成的关键因素，提示miR-27a可能通过抑制下游靶基因FAS、SCD1抑制肝星状细胞脂质代谢。

讨 论

文献报道，miR-27在肝脏脂质代谢紊乱时表达受到抑制[19]。Zhang等[20]发现在肝原代细胞中，miR-27a能通过抑制脂肪酸合酶(fatty acid synthase，FAS)和硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1 ，SCD1)调节肝脏脂质代谢从而减轻NAFLD。FAS、SCD1是高等动物内源性脂肪酸合成的重要的酶，其在肝脏中的表达水平与肝脏脂肪变性的程度相关[21-23]。肝星状细胞的活化一直被认为是肝纤维化发生的启动步骤[18]，但肝星状细胞在脂肪肝发生发展过程的变化鲜见报道。本课题组前期实验发现，在PA诱导脂肪变性的肝星状细胞中miR-27a相对表达量出现显著下降，说明肝星状细胞脂肪变性时，miR-27a的表达也会受到抑制。同时检测小鼠肝脏组织中miR-27a的相对表达量发现，相比较普食加CCL4组的小鼠，高脂加CCL4组小鼠miR-27a表达量也明显下降， miR-27a的表达在脂肪变性的肝细胞中受到抑制[21]。本实验结果表明在肝脏脂肪变性时，miR-27a的表达不仅会在肝细胞中受抑制，肝星状细胞也会出现同样的现象。将肝星状细胞过表达miR-27a，油红检测脂质沉积发现，相比对照组，过表达组肝星状细胞中脂质沉积明显减轻，说明在肝星状细胞中，miR-27a可能是通过抑制脂质沉积来减缓脂肪变性的进程；同时PCR结果显示，过表达miR-27a后的肝星状细胞中促脂肪酸合成因子FAS、SCD1的mRNA表达量均显著下降，而高脂加CCL4组小鼠肝组织FAS、SCD1相关mRNA表达量显著高于普食加CCL4组小鼠的表达水平，提示在肝星状细胞中，miR-27a可能是通过抑制这两种酶的表达导致脂肪酸合成减少进而抑制脂质沉积，逆转脂肪变的发生发展。

本研究中结果表明，miR-27a可抑制肝星状细胞的脂质代谢，这一作用的发挥可能是通过促进FAS、SCD1在脂质代谢过程的作用，但是进一步的相关机制尚未清楚。探讨肝星状细胞中 miR -27a 表达水平与肝脂肪变的关系，可为研究肝脂肪变提供一个不同的思路。