hsa-miR-10a-5p在重症社区获得性肺炎中的应用研究

叶 君，刘丹瑜，何 权，黄凤鸣，朱华栋，徐 军*，蒋澄宇*

(1.中国医学科学院 基础医学研究所, 北京协和医学院 基础学院 生物化学与分子生物学系， 北京 100005；2.中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院 急诊科，北京 100730；3.北京大学第一医院呼吸和危重症医学科，北京 100034)

肺炎是一种常见的呼吸系统疾病，被认为是各种传染病的主要死亡原因[1]，也是世界范围内住院和死亡的主要原因之一[2]。根据患者发病地点的不同，肺炎可分为社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP) 和院内获得性肺炎(hospital-acquired pneumonia, HAP)。根据不同的多中心队列研究，重症社区获得性肺炎(severe community acquired pneumonia, SCAP) 的病死率为17%～49%[3]。优化SCAP患者的早期诊断方法和评估预后手段能很好地辅助医师把握患者的病情，有效制定治疗策略。microRNA是短的(20～24 nt) 非编码RNA，通过影响mRNA的稳定性和翻译，参与多细胞生物中基因表达的转录后调控。hsa-miR-10a-5p(MIMAT0000253, UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG)序列长23个核苷酸，在智人中发现。hsa-miR-10a-5p可调控日本血吸虫感染的肝纤维化[4]，在正常的子宫肌层和平滑肌瘤中差异表达[5]，还可作为地方性伯基特淋巴瘤(endemic Burkitt lymphoma) 的潜在标志物[6]。目前尚无报道hsa-miR-10a-5p在肺炎中的作用。本研究通过microRNA测序、相关性分析以及受试者工作特征曲线下面积(area under the receiver operating characteristic curve, AUC) 来评估hsa-miR-10a-5p作为SCAP标志物的潜能，通过mRNA测序和靶基因预测及基因功能富聚类的方法探究hsa-miR-10a-5p在SCAP中的作用。

1 材料与方法

1.1 样本来源

本研究纳入了2013年4月至2016年1月北京协和医院急诊重症监护病房的SCAP患者41例，同时还招募了10名健康对照。其中SCAP患者定义为收入急诊重症监护病房并诊断为CAP的患者。该研究通过了北京协和医学院伦理委员会的批准(审批文号：S-500) 并获得每个参与者的知情同意。

本研究记录了患者的基本个人信息，包括年龄、性别、吸烟史、饮酒史和基础疾病史。记录患者病情和治疗情况，包括体温、疾病转归、是否合并急性呼吸窘迫综合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)、是否应用激素治疗、是否行气管插管和体外膜肺氧合(extracorporeal membrane oxygenation, ECMO) 治疗。记录患者的血液化验结果，包括血常规、肝肾功能、凝血功能、C反应蛋白、降钙素原(procalcitonin, PCT)。分别计算急性生理功能和慢性健康状况评分系统Ⅱ(the acute physiology and chronic health evaluation Ⅱ, APACHE Ⅱ) 评分,CURB-65(C, 意识, consciousness; U, 血中尿素氮, blood urea nitrogen; R, 呼吸频率, respiratory rate; B, 血压, blood pressure; 65, 年龄≥65岁, age≥65) 评分、肺炎严重程度指数(pneumonia severity index, PSI) 评分和序贯器官衰竭评估(sequential organ failure assessment, SOFA) 评分来评估肺炎的严重程度。细菌检测采用传统培养方法，病毒检测采用实时定量PCR方法。

1.2 方法

1.2.1 样本处理:用无菌抗凝管采集SCAP患者和健康人外周静脉血标本，离心分离血清和血细胞。用红细胞裂解缓冲液(索莱宝公司) 裂解红细胞，使用TrizolTM试剂(Invitgen公司) 按照标准方案提取白细胞中的总RNA。

1.2.2 RNA测序及测序数据处理:RNA定量和RNA测序由Novogene生物信息学技术有限公司完成。测序数据使用FastQC 0.11.2 来控制链特异双末端测序读段的质量。Bowtie2 2.1.0 和Tophat2 2.0.11 用于将测序读段映射到人类基因组(版本hg19,http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads.html)上。使用Cufflinks 2.2.1、Cuffmerge 2.2.1和Cuffdiff 2.2.1 软件处理转录单位，计算基因表达水平(fragments per kilobase of transcript per million frag-ments mapped, FPKM值)，并识别差异表达基因。

1.2.3 预测microRNA靶点:microRNA在miRDB(microRNA target prediction database, http:// www.mirdb.org/expression.html) 和Targetscan7.2(http://www.argetscan.org/vert_72/) 平台进行靶基因预测，将两个平台预测到的靶基因进行重合比对，取两个平台共有的靶基因进行下一步分析。

1.2.4 基因功能富集分析:使用Metacore(Clarivate Analytics公司) 软件分析差异表达基因的功能途径。FDR<0.1、P<0.05为差异有统计学意义。选取前200条差异显著的通路和生物学过程，使用Cytoscape 3.6.1软件和Enrichment Map application 3.1.0进行可视化。

1.3 统计学分析

采用Mann-WhitneyU检验确定两组间的差异。线性相关分析采用Spearman秩相关系数。预测分析采用受试者工作特征(receiver operating characteristic, ROC) 曲线。利用GraphPad Prism 6进行Mann-WhitneyU检验。采用SPSS统计软件25.0进行Spearman秩相关分析和AUC计算。

2 结果

2.1 下调的hsa-miR-10a-5p表达水平与CAP严重性相关

最终共37位受试者(SCAP患者27例，健康对照10名) 的第一个时间点样本被选用。对27例SCAP患者根据预后转归分类分为存活组19例，死亡组8例，进行基础信息和临床信息记录。其中APACHE Ⅱ评分(P<0.001)、ARDS(P<0.05)、血糖(P<0.05)、淋巴细胞(P<0.000 1)、白细胞计数(P<0.001)和中性粒细胞计数(P<0.001) 在存活与死亡组之间有显著性差异(表1)。

表1 根据预后转归分类的SCAP患者的临床特征单变量分析Table 1 Univariable analysis of the clinical characteristics of SCAP patients according to the prognostic outcome classification

续表1

对hsa-miR-10a-5p的表达量进行显著性分析。相较于健康对照组，SCAP组的microRNA表达量显著降低(P<0.01)(图1A)。将SCAP组hsa-miR-10a-5p的表达量分为存活组和死亡组，死亡组的microRNA表达量相较于健康对照组显著降低(P<0.000 1)(图1B)，死亡组的microRNA表达量相较于存活组显著降低(P<0.05)。SCAP的预后越差，hsa-miR-10a-5p的表达量越低。

A.Boxplot of hsa-miR-10a-5p level in healthy control(n=10) and SCAP patients(n=27); B.Boxplot of hsa-miR-10a-5p level in healthy control(n=10) and SCAP patients according to prognostic outcome classification(survive group n=19; non-survive group n=8); the horizontal line represents the median; the bottom and the top of the box represent 25th and the 75th percentiles; whiskers represent the minimum and the maximum； *P<0.01, **P<0.000 1 compared with healthy group图1 hsa-miR-10a-5p水平在SCAP组和死亡组中显著下调Fig 1 hsa-miR-10a-5p level was significantly down-regulated in SCAP group and non-survive group

对hsa-miR-10a-5p的表达量与SCAP患者的临床参数进行相关性分析。其中除了血气乳酸(lactic acid, lac)(P<0.05) 与表达量有稍弱相关性以外，该microRNA表达水平与APACHE Ⅱ 评分(P<0.05)、红细胞计数(P<0.01)、淋巴细胞百分比(P<0.05)、血细胞比容(hematocrit)(P<0.05)、心衰敏感指标(N terminal pro B type natriuretic peptide/brain natriuretic peptide, NT-proBNP/BNP)(P<0.05)、凝血指标(activated partial thromboplastin time, APTT)(P<0.05) 和PCT(P<0.05) 都有中等相关性(图2)。microRNA水平与APACHE Ⅱ评分、NT-proBNP/BNP、血气乳酸和PCT都呈负相关，而与APTT、红细胞计数、淋巴细胞百分比和血细胞比容呈正相关(图2)。其中该microRNA水平与APACHE Ⅱ 评分呈负相关，说明hsa-miR-10a-5p的表达量越低，APACHE Ⅱ 评分越高，即hsa-miR-10a-5p的表达量越低，疾病严重程度越高。

Spearman rank correlation analysis between hsa-miR-10a-5p level and clinical parameters in SCAP patients(n≤27, n is the amount of data available for each parameter); both horizontal and vertical coordinates have taken the log10 value图2 hsa-miR-10a-5p水平与SCAP患者的临床参数相关Fig 2 hsa-miR-10a-5p level was correlated with the clinical parameters of SCAP patients

2.2 hsa-miR-10a-5p预测的靶向基因与肺炎的发展密切相关

对41个SCAP样本(覆盖了本次microRNA测序的27个样本) 和10个健康对照样本进行mRNA测序。对mRNA测序结果进行差异分析，筛选出P<0.05、差异倍数(fold change, FC)>2或<0.5的差异基因。将这些差异基因与hsa-miR-10a-5p(UACCCUGUAGAUCCGAAUUUGUG) 预测的靶基因进行重合比对，取共有的差异基因进行聚类分析。

生物学过程聚类结果中可看到除了主要的炎性反应和免疫相关生物学过程以外，结果中也出现了细胞骨架和细胞黏附相关的生物学过程(图3A)，这可能与病原体感染过程相关。通路聚类结果中同样也看到炎性反应和免疫、细胞骨架和细胞黏附，还出现了癌症与肿瘤相关的以及细胞生长相关的通路(图3B)。这些通路都与肺炎的发展密切相关。

A.biological process clustering diagram of hsa-miR-10a-5p targeted genes(n=26); B.pathway clustering diagram of hsa-miR-10a-5p targeted genes(n=26); node size represents the number of differentially expressed genes(DEGs) in the gene set; node color reflects the enrichment score(FDR value); the edge line represents the overlap of DEGs图3 hsa-miR-10a-5p预测的靶向基因的功能聚类分析Fig 3 Functional cluster analysis of targeted genes predicted by hsa-miR-10a-5p

2.3 hsa-miR-10a-5p的表达水平可以预测SCAP患者的不良结局

根据疾病预后转归分类计算了hsa-miR-10a-5p表达水平的AUC，结果显示hsa-miR-10a-5p的表达水平具有良好的预后预测能力(AUC=0.776)。

3 讨论

多个研究表明，hsa-miR-10a-5p在癌症中发挥重要的作用，例如上调的hsa-miR-10a-5p抑制宫颈癌细胞的活力和细胞周期进程[7]；抑制hsa-miR-10a-5p来降低胆管癌细胞的生长[8]；hsa-miR-10a-5p抑制肾细胞癌细胞的迁移和侵袭[9]；hsa-miR-10a-5p直接参与胃癌转移的主要机制[10]。这些研究说明hsa-miR-10a-5p在不同的癌症中发挥不同的作用。有研究采用生物信息学方法发现hsa-miR-10a-5p在生长发育及肿瘤发生发展过程中起重要作用[11]。本研究也发现hsa-miR-10a-5p预测的靶向基因与肿瘤和癌症以及生长发育密切相关，说明hsa-miR-10a-5p在生长发育方面和病理情况下发挥着不可忽视的作用。

本研究通过显著性分析发现hsa-miR-10a-5p水平在SCAP中显著下调，且在死亡组中下调更明显，提示hsa-miR-10a-5p水平能区分健康对照与SCAP患者，且能指示肺炎的严重程度。hsa-miR-10a-5p水平与APACHE Ⅱ 评分、NT-proBNP/BNP、血气乳酸和PCT都呈负相关，而与APTT、红细胞计数、淋巴细胞百分比和血细胞比容呈正相关，这些结果都与临床经验相一致。hsa-miR-10a-5p水平与APACHE Ⅱ 评分呈负相关提示hsa-miR-10a-5p水平能指示肺炎的严重程度。microRNA水平预测疾病预后的AUC为0.776，提示hsa-miR-10a-5p水平能很好地预测SCAP的不良结局。这些结果都支持hsa-miR-10a-5p可以作为SCAP的潜在标志物。

功能富集分析结果表明在SCAP发生时，hsa-miR-10a-5p预测的靶向基因能调控与肺炎发展密切相关的生物学过程和通路。具体来说，hsa-miR-10a-5p可能参与前期病原体侵入(细胞骨架和细胞黏附相关生物学过程和通路)、免疫系统发挥作用(免疫和炎性反应相关生物学过程和通路) 和生理和病理情况下的调控(细胞生长和癌症与肿瘤相关生物学过程和通路)，提示hsa-miR-10a-5p在SCAP中的重要作用。