基于“碘-罗丹明B”复合型荧光探针返荧光猝灭法测定食用油碘值

薛林科 戴兴德 张小林

(甘肃医学院公共课教学部, 平凉 744000)

油脂作为三大营养物质之一，向人体提供能源和必需脂肪酸[1,2]，碘值是评价油脂不饱和程度的重要参数[3]，碘值越高则说明油脂不饱和程度愈大，对人体健康越有利，因此碘值的测定在油脂日常检测中具有十分重要的意义[4,5]。油脂碘值的测定方法主要分为化学法和红外光谱法[6,7]。化学法中韦氏法作为国家标准最为常用[8,9]，准确度高，稳定性好，但测定过程较为复杂。将返荧光技术应用于油脂碘值分析，国内鲜见报道。

罗丹明B(Rhodamine B, RB)具有荧光特性，I3-离子可通过静电引力与RB的阳离子形成离子缔合物，并使其荧光猝灭[10-13]。韦氏液主要成分为ICl，具有强氧化性，加入过量碘化钾生成可溶性碘(I3-)，碘溶液(I3-)和RB混合的瞬间即可发生荧光猝灭现象，若在韦氏液中提前加入不饱和油脂，ICl因与不饱和键发生加成，缔合物“RB-I3-”中的I3-减少，溶液重新发出荧光，其荧光强度变化值与油脂碘值在一定范围内有相关性，据此实现返荧光猝灭法测定油脂碘值，其过程不受样品浑浊度和色度影响且有极低的检出限。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

930N荧光分光光度计，pHS-3C精密pH计。

一氯化碘、RB、醋酸、醋酸钠、冰醋酸、碘化钾：均为分析纯；水为二次蒸馏水。

1.2 溶液配制

韦氏标准液(ICl)：5.00×10-4mol/L。1.6 g氯化碘溶于100 mL环己烷和冰乙酸的等体积混合溶剂中，用硫代硫酸钠标定其浓度，将标定液二次稀释为5.00×10-4mol/L，低温避光保存。

RB标准溶液：准确称取0.119 8 g RB固体，加水溶解并稀释定容至250 mL，配成浓度为1.00×10-3mol/L的标准溶液，作为储备液，使用时稀释至1.00×10-4mol/L。

10%碘化钾溶液；0.1 mol/L醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 4.5)。

1.3 方法原理与量值追溯

过量韦氏液(ICl) 与油脂中的不饱和双键进行定量的加成反应：

剩余ICl与碘化钾生成可溶性碘(I3-)：

ICl+KI=I2+KCl

I2+I-= I3-

在弱酸环境下，I3-与RB阳离子通过静电引力形成缔合物，缔合反应导致罗丹明B荧光猝灭，油脂加入前后猝灭程度有差异。

量值追溯是基于原始记录而实现，包括样品来源、溶剂类型、取样量、试剂用量、仪器参数、荧光测定等方面，荧光强度F是原始记录，油脂加入前后荧光强度变化值ΔF体现其不饱和度(碘值)，通过与国标(韦氏法)作比较，可实现返荧光猝灭法的量值追溯。

1.4 实验方法

1.4.1 样液制备

准确称取油脂样品5 g于100 mL容量瓶中，加入50 mL混合溶剂 (环己烷和冰乙酸等体积混合) 振荡溶解，最后用混合溶剂定容，将该溶液再次稀释100倍作为样品处理液。

1.4.2 样品测定

准确移取10 μL样液于50 mL容量瓶中，加韦氏液0.20 mL，塞紧瓶塞，摇匀后室温静置60 min，加10%碘化钾液1 mL，RB溶液 5.00 mL，醋酸-醋酸钠缓冲溶液5 mL，蒸馏水定容，静置5 min后，以365 nm作激发波长，580 nm作发射波长，1.00×10-6mol/L RB作灵敏度调试液，测定荧光强度F。同时完成样品空白实验F0测定，按公式计算食用油碘值(g/100 g)。

ΔF=F-F0

式中：M为样品质量/g；126.9为I+摩尔质量/g/mol；k为标准曲线斜率(k=100.1)。

1.4.3 过程比较

国标方法(韦氏法)与返荧光猝灭法过程比较见表1。

表1 两种方法测定过程比较

2 结果与讨论

2.1 荧光光谱

RB、ICl+KI+RB、油脂+ICl+KI+RB三种体系的荧光光谱见图1。结果表明，当λex=365 nm时，RB在580 nm处有一最大荧光峰(曲线a)，加入韦氏液和碘化钾反应液后，荧光猝灭，但峰位未发生改变(曲线b)，说明RB和碘(I3-)发生了缔合；在RB-I3-缔合物形成之前按照“油脂+ ICl+I-+RB”顺序加入油脂，荧光得以恢复(曲线c)，即荧光强度与油脂不饱和度有关联。

注：a为RB体系；b为ICl+KI+RB体系；c为油脂+ICl+KI+RB体系。图1 不同体系的荧光光谱

2.2 RB用量的确定

在醋酸-醋酸钠缓冲介质中，完成不同体积RB稀释液的荧光荧光强度测定。其结果说明RB在0～5 mL范围内稀释液荧光强度与体积有线性关系，当V(RB)>5 mL时，荧光强度趋于恒定，该结果与文献[18]报道相一致，即当c(RB)≥1.0×10-2mmol/L时，RB会形成二聚体或多聚体，自熄灭作用增强，线性度消失。故RB溶液用量确定为5.00 mL。

2.3 缔合物pH环境考察

由于pH对RB[10]和碘(I3-)的存在形式有明显影响，进而影响RB与I3-之间的缔合作用，在最佳试剂用量条件下，改变“ICl+KI+RB”体系pH值进行试验。图2表明，随着pH值的增加，RB荧光强度逐渐增大；pH 4.0～8.0时，荧光强度趋于恒定；pH值大于9.0时，缔合物中的I3-发生歧化(I3-+2OH-=IO-+ 2I-+H2O)，体系荧光强度出现二次增大。pH介于4.0～8.0时，更有利于RB和I3-缔合，本方法选择pH=4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液作荧光探针缓冲介质。

2.4 反应时间和温度的确定

取10 μL样品处理液，在最佳试剂用量条件下，分别改变“油脂+ICl+KI+RB”体系加成反应时间和反应温度进行实验，结果表明，油脂不饱和键与I+反应速度较慢，在0～50 min内体系荧光强度呈恢复态势(图3)，50 min后荧光强度达到最大并趋于恒定，故韦氏液加入后静置时间确定为60 min。升高温度，“油脂+ICl+KI+RB”体系荧光强度增强，缔合作用减弱；当温度超过60 ℃时，体系荧光强度与单纯RB体系趋于一致，猝灭现象消失，因此，测定在室温下进行。

图2 pH条件影响

图3 动力学曲线

图4 韦氏液用量影响及标准曲线

2.5 标准曲线

针对“ICl+KI+RB”体系，在已确定的实验条件下，仅改变韦氏(ICl)标准溶液用量(0～0.5 mL)，按实验方法测定荧光强度。图4表明，随着韦氏液量的增加，RB的荧光强度逐渐降低，当韦氏液加入量增加到0.25 mL时，RB的荧光强度开始呈现平缓趋势，0.40 mL时RB的荧光强度趋于稳定。在0～0.2 mL范围内二者有较好线性度，即碘(I+)浓度在0～2 μmol/L范围内与体系荧光强度(F)有良好的线性关系(图4内插图)，线性方程为F=230.8-100.1c(μmol/L)，相关系数r=0.984 5，韦氏碘(I+)检出限为3.2×10-9mol/L，该曲线作为食用油碘值测定模型方程。

2.6 样品分析与模型检验

取一定量样品, 按实验方法测定碘值。另取一定量样品用碘量法进行对比，结果见表2。

表2 样品分析(n=6)

两种方法具有较好的精密度，荧光法相对标准偏差RSD控制在0.33%～1.56%范围内，满足仪器分析要求，荧光法测定结果与碘量法相比较，相对误差RE≤1.86%。按文献[15]所给方法对表1中棕榈油的测定结果进行t检验表明，荧光法和国标法之间无显著性差异，由此可见，该模型用于测定食用植物油碘值是可行的。

3 结论

本研究基于“碘-罗丹明B”缔合物荧光探针实现返荧光猝灭法测定食用油脂碘值，方法简单且具有很好的灵敏度；在580 nm发射波长处，RB取5.00 mL，pH 4.5的醋酸-醋酸钠缓冲溶液作缓冲介质，反应50 min后，加成碘检测限达到3.2×10-9mol/L；统计结果表明，荧光法可代替碘量法(国标法)用于油脂碘值测定。