响应面法优化啤酒大麦芽黄酮提取工艺的研究

米 智 武晓红 刘荔贞

(山西大同大学生命科学学院1，大同 037009) (山西大同大学化学与环境工程学院2，大同 037009)

大麦(HordeumvulgareL.)属禾本科一年生草本植物，是世界上最主要、最古老的栽培作物之一[1]，一直被认为是重要的谷物之一，中国大麦种植面积和总产量居水稻、小麦、玉米和粟之后，列第五位[2]。其产量在世界粮食作物中居第4位，仅次于小麦、水稻和玉米[3]。

大麦不仅是重要的粮食作物，还是药用植物、饲料作物和酿酒作物，尤其麦芽具有多种药理作用，广泛应用于临床。大麦籽粒营养成分丰富、全面，含有高纤维、高维生素、低脂肪、低糖、多种微量元素以及β-葡聚糖、α-生育三烯醇、黄酮、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、抗性淀粉[4]、多酚、黄酮、类黄酮等功能成分[5，6]。大麦中纤维具有低血糖指数，对糖尿病患者日常生理功能维持有益[7]。大麦还富含β-葡聚糖等植物化学物质，其在预防心血管疾病(CVD)[8]、癌症[9]和肥胖等常见营养相关疾病[10]方面有着极其重要的作用。由大麦制成的全麦食品被认为是人类的“健康食品”[11]。

大麦麦芽为中医临床上常用的一味消食药，是由成熟大麦果实经发芽干燥而得。用水浸泡麦粒，保持适宜温、湿度，待3～6 d幼芽长至约0.5 cm时，进行干燥即得生麦芽。《中国药典》载：麦芽甘平行气消食、健脾开胃、退乳消胀，用于食积不消、脾虚食步、乳汁郁积、乳房胀痛、妇女断乳、肝胃气痛[12]。麦类麦芽中含有丰富的黄酮类化合物、麦芽酚、麦角类化合物、β-葡聚糖、尿囊素、淀粉酶、α-生育三烯酚、转化糖酶、催化酶、过氧化异构酶等。另含α-科醌、大麦芽碱、大麦芽胍碱、腺嘌呤、胆碱、蛋白质、氨基酸，维生素B、D、E，细胞色素等[13-16]。研究发现，大麦在发芽过程中，可分解一些抗营养物质，产生新物质或增加已有营养物质的含量[1]，有助于大麦营养物质的富集，并且可以极大地提高各种酶的活性，使其保健功效发挥更充分[17]。Kanauchi等[18-20]研究表明，发芽大麦具有改善通便、防治腹泻功效，还对结肠炎有较好的预防和治疗作用。

大麦芽中含量丰富的黄酮类化合物是中药等领域的研究热点，其黄酮类成分主要有儿茶素、芦丁、橙皮甘、杨梅素、槲皮素和山柰酚[21]等，具有抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗癌防癌等方面的功能[13,22,23]，也能降低血管的脆性及异常的通透性作用，可用作防治高血压及动脉硬化的辅助治疗剂，其中儿茶素还具有抗肝脏毒作用，黄酮类化合物二氢槲皮素具有抗炎作用等[24]，麦芽中含有的麦黄酮还有改善记忆，治疗老年痴呆症的功能[25]。麦芽中的类黄酮，对DNA修复有一定的作用[13]。

大麦资源虽在我国非常丰富，但多集中于品种筛选、种植栽培等方面，而对大麦尤其大麦芽的功能特性、医疗保健、及其深加工等方面的研究和利用还不够深入。黄酮的提取方法很多，其中索氏提取法具有选择性好、能耗低、设备、操作简便等优点，适于实验室应用；黄酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂，但甲醇和丙酮均具有一定的毒性，乙醇无毒且沸点低，适于索氏提取法对黄酮的提取，且使用乙醇为提取剂时回收利用方便，得率高，有利于降低生产成本[26]。本研究以啤酒大麦芽为研究对象，利用响应面实验探究索氏提取法提取大麦芽黄酮的最佳工艺条件，为大麦芽黄酮的药用研究和开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒大麦芽，芦丁标准品，无水乙醇，硝酸铝，亚硝酸钠，氢氧化钠等。

1.2 仪器与设备

恒温水浴锅、酸度计、精密电子天平，真空抽滤装置、数显恒温水浴锅、紫外/可见分光光度计，高速中药粉粹机，索氏提取器等。

1.3 方法

1.3.1 芦丁标准曲线的建立

准确称取芦丁标准品10 mg，加少量乙醇，在超声波辅助下，摇匀使之充分溶解并定容至50 mL，得0.2 mg/mL芦丁标准液[27]。

取6个干燥洁净的25 mL容量瓶，芦丁标准曲线的制作见表1。

表1 芦丁标准曲线的制作

以0号容量瓶为空白对照，在510 nm处用紫外/可见分光光度计测定吸光值，测3次求平均值，做回归处理。

1.3.2 大麦芽处理及黄酮提取工艺流程

选择无发霉、无机械伤、无病虫害、颗粒饱满的大麦芽种子，放入电热恒温鼓风干燥箱中，在50 ℃下干燥2 h后，用万能粉碎机粉碎成大麦芽粉末，并使大麦芽粉通过60目筛，收集大麦芽粉末于干燥的容器中待用。

黄酮提取工艺流程为：大麦芽→清选→烘干→粉碎→过筛→称重→分装小包→乙醇提取浸提→提取液定容→测定吸光值→计算提取量

1.3.3 大麦芽总黄酮的测定方法

精确量取1 mL提取液做为待测液，方法同1.3.1，在510 nm处测吸光值，做3组平行实验求平均值，代入线性回归方程，得到大麦芽总黄酮的含量公式：

式中：C为大麦芽总黄酮质量浓度/mg/mL；N为稀释的倍数；V为提取液总体积/mL；W为实验样品的质量/g。

1.3.4 大麦芽总黄酮提取工艺的单因素实验[28]

1.3.4.1 乙醇浓度

准确称取2 g大麦芽粉末，在料液比(g/mL)为1∶15、提取时间为1 h、提取次数为2次的前提下，设置乙醇体积分数为50%、60%、70%、80%、90%提取大麦芽中的总黄酮，并在510 nm处测定提取液的吸光值，并计算黄酮提取量。

1.3.4.2 料液比

准确称取2 g大麦芽粉末，在乙醇体积分数为60%、提取时间为1 h、提取次数为2次的前提下，设置料液比为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)提取大麦芽中的总黄酮，并在510 nm处测定吸光值，并计算黄酮提取量。

1.3.4.3 提取时间

准确称取大麦芽粉末2 g，在乙醇体积分数为60%、料液比为1∶15、提取次数为2次的前提下，设置提取时间为1、1.5、2、2.5、3 h提取大麦芽中的总黄酮，并在510 nm处测定吸光值，并计算黄酮提取量。

中国书画千年历史，不能断了香火，后辈学子首先是在老祖宗灵位前嗑头下跪，老老实实把老师那点东西学到手，添油加柴，把家传本领好好学到家。

1.3.5 响应面实验设计及统计学处理方法

根据大麦芽总黄酮提取工艺的单因素实验结果，从乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)3个因素中，分别选取3个对大麦芽总黄酮提取量影响最大的水平，以黄酮提取量为考察目标，运用Design-Expert V8.0.6.1软件进行响应面实验设计，根据Box-Behnken中心组合设计原理，确定相应面试验方案，并建立回归方程预测模型确定最佳提取工艺参数。

1.3.6 大麦芽总黄酮提取工艺的验证性实验

为了更好的证实索氏提取法提取大麦芽总黄酮的可靠性和合理性，在响应面实验结果的基础上，进行了3次平行验证性实验，并计算相对标准偏差(RSD)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

以芦丁浓度为横坐标，吸光值OD510为纵坐标，制作标准曲线，得出线性回归方程为：y=9.107x-0.112，R2=0.993。

2.2 大麦芽总黄酮提取工艺的单因素实验结果

由图1可以得到，当乙醇体积分数低于60%时，大麦芽黄酮提取量随乙醇浓度增大而提高，在乙醇体积分数为60%时黄酮提取量达到最大，约为56 mg/100 g，当乙醇体积分数超过60%后，随着乙醇浓度的提高，黄酮提取量反而降低。因此在做响应面实验时，选取乙醇体积分数分别为50%、60%、70%。

图1 乙醇浓度、回流时间和料液比对大麦芽黄酮提取量的影响

大麦芽黄酮提取量随着料液比的增大而提高，当料液比为1∶15时，大麦芽黄酮提取量达到最大值，约为55 mg/100 g，当料液比继续增大时，黄酮提取量反而降低。因此在做响应面试验时，选取料液比分别为1∶10、1∶15、1∶20。

当提取时间不足2 h时，大麦芽黄酮提取量随提取时间延长而提高，且提取2 h时黄酮提取量达到最大值，约为58 mg/100 g，随着提取时间的延长，大麦芽黄酮提取量反而有所降低，因此在做响应面试验时，选取提取时间分别为1.5、2、2.5 h。

2.3 回归模型的建立及其分析

响应面分析因素与水平见表2。

表2 响应面分析因素与水平

响应面试验方案与结果见表3。

表3 响应面试验方案与结果

建立啤酒大麦芽黄酮提取工艺参数的回归模型，获得本实验评价指标(黄酮提取量)的响应值对自变量A(乙醇浓度)、B(料液比)和C(提取时间)的二次多项式回归方程：黄酮提取量=-372.525+9.757 5×A+2119×B+76.6×C+6×AB+0.45×AC+180×BC-0.093 5×A2-18 960×B2-30.4×C2。

回归模型方差分析见表4。

表4 回归模型方差分析

以啤酒大麦芽黄酮提取量为评价指标对该模型进行方差分析及模型系数进行显著性检验(表4)。回归模型在统计学上呈极显著(P=0.00 63<0.01)，说明实验模型有统计学意义；且通过P值可知模型中变量A2、B2、C2对提取量影响显著，说明实验因素与响应值不是简单的线性关系，二次项对相应值有很大的关系，三因素的交互作用影响相对较小；失拟项P=0.595 8>0.05，不显著，说明实验模型拟合度较好，模型的残差可能来源于实验过程的随机误差。模型的校正决定系数R2=0.910 1，说明实验误差较小，有91.01%来解释该模型中响应值的变化。在所选取的各因素水平范围内，按照对响应值的影响顺序为：提取时间(C)>乙醇浓度(A)>料液比(B)，但这3个因素均对黄酮提取量影响均不显著(P>0.05)。

通过三维响应面图和二维等高线图分析显示，随着乙醇浓度、料液比和提取时间的增大或延长，啤酒大麦芽黄酮提取量也随之增大，但当浓度、料液比和提取时间增大或延长到一定程度后，黄酮提取量有下降的趋势，三因素之间的交互作用不显著，等高线图中的椭圆程度和疏密程度也相当，与模型回归中的方差分析一致。

2.4 最佳提取条件的确定

由响应面法试验分析数据可得出啤酒大麦芽中黄酮最佳提取取工艺为：乙醇体积分数为59.18%、料液比为1∶14.2 9、提取时间为1.92 h，最佳提取量为68.43 mg/100 g。考虑实验室操作的可行性，修正提取工艺条件乙醇体积分数为60%、料液比为1∶15、提取时间为2 h。

2.5 优化条件的验证性实验

根据响应面试验筛选出大麦芽黄酮提取最佳工艺，进行3组平行实验，验证响应面实验结果的可靠性和准确性。验证性实验测定大麦芽黄酮提取量见表5。3组平行样数据RSD为3.83%，满足要求，得出该提取工艺大麦芽黄酮提取量较为稳定。

表5 验证性实验测定大麦芽黄酮提取量

3 结论

由响应面实验结果及方差分析可知，索氏提取法提取大麦芽黄酮的最佳工艺为：乙醇体积分数为60%，料液比为1∶15和提取时间为2 h。影响程度为：提取时间>乙醇浓度>料液比，3个因素对大麦芽黄酮提取量影响不显著。通过验证性实验可知，该工艺黄酮提取量最高，相对标准偏差较小(3.83%)，响应面实验能对各个因素及各因素之间的交互分析更全面，更细致，较为准确地分析出因素间最佳组合，实验稳定可靠。