乌药叶中总黄酮的含量测定及提取工艺优选

孙 嫣 业 康 毛培江 王志安#

1 杭州市第一人民医院 浙江 杭州 310006

2 浙江省中药研究所有限公司 浙江 杭州 310023

乌药，为樟科植物乌药Lindera aggregata（Sims）Kosterm的干燥块根，有行气止痛、温肾散寒的功效。乌药作为浙江的道地药材，使用至今已经有一千多年的历史，其具有良好的医用价值。本实验采用紫外分光光度法测定乌药叶提取物中总黄酮含量，并对影响提取总黄酮的因素进行了考察，通过正交试验优选出最佳提取工艺，为中药新药的研发提供技术支持。

1 试剂与仪器

1.1 实验药品与试剂：乌药叶干品由浙江红石梁集团天台山乌药有限公司供给，于当年春季的浙江天台地区，经蒸（杀青）、揉捻、干燥（温度55～60℃，时间6～7h）等工序加工制得，由浙江中药研究所有限公司中药资源室鉴定为樟科胡椒属植物乌药[Lindera aggregata（Sims）Kosterm.]的叶片（批号为20180501）；芦丁对照品，由中国食品药品检定研究院提供（批号为100080-201610），纯度为92.6%；95%乙醇为食品级；无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、甲醇均为分析纯；实验用水为纯化水，提取用水为饮用水。

1.2 实验仪器：上海亚荣RE-5210A旋转蒸发仪；Shimadzu UV-2550型紫外可见分光光度计；上海精宏DKS24型电热恒温水浴锅；昆山KQ-100DB型超声波提取仪。

2 方法与结果

2.1 乌药叶提取工艺的优选：分述如下。

2.1.1 乌药叶提取溶剂的选择：前处理：乌药叶粉碎，过20目筛。水提物：乌药叶粗粉200g加入6倍量的水煎煮提取2次，每次1小时，提取液减压浓缩（60℃，－0.07～－0.1Mpa）至1g生药/ml。醇提物：乌药叶粗粉200g加入6倍量70%乙醇回流提取2次，每次0.5小时，提取液减压浓缩（60℃，－0.07～－0.1Mpa）至1g生药/ml。乌药叶水提和醇提两种方式的固形物提取率分别为12.49%和10.67%，总黄酮提取率分别为2.21%和3.46%，说明两种方法都可以提取总黄酮。

2.1.2 乌药叶醇提工艺参数优选：为了确定乌药叶的最佳提取条件，按总黄酮提取率（%）为主要指标，以单因素实验考察提取溶剂乙醇的浓度，实验设置50%、70%、90%3个水平，乌药叶粗粉200g分别加各个浓度的乙醇6倍量提取2次，每次0.5小时，提取液减压浓缩（60℃，－0.07～－0.1Mpa）至1g生药/ml。结果显示，乌药叶在70%乙醇提取固形物提取率较低，总黄酮提取率为3.46%，提取率最高。

选用L9（34）表对乌药叶提取次数（A）（1次、2次、3次）、提取时间（B）（0.5h、1h、1.5h）、溶剂用量（C）（4倍、6倍、8倍）3个因素进行醇提正交实验，根据各个因素均确定为3个水准。在70%乙醇提取的乌药叶中正交实验记录见表1、表2，方差法结果表明：FA＞F0.05（2，2），因素A的水平变化对本次实验结果有显著性影响，本实验提取工艺的最佳方案为：乌药叶加6倍量70%乙醇提取2次，第1次1小时，第2次0.5小时，可获得较好的提取效果。

表1 乌药叶总黄酮乙醇提取正交实验

表2 方差分析表

2.1.3 乌药叶水提工艺参数优选：选用L9（34）表对提取次数（A）（1次、2次、3次）、提取时间（B）（0.5h、1h、1.5h）、溶剂用量（C）（6倍、8倍、10倍）3个因素进行水提正交实验，根据每个因素均确定为3个水平，按优化的醇提工艺提取后的乌药叶药渣再用水作为溶剂进行提取，药材量按最初投料量计。正交实验记录见表3、表4，方差法结果表明：FA＞F0.05（2，2），因素A的水平变化对实验结果存在显著性影响，提取工艺的最佳方案为：乌药叶加8倍量水提取2次，第1次1小时，第2次0.5小时，可获得较好的提取效果。

表3 乌药叶总黄酮水提取正交实验

表4 方差分析表

2.2 乌药叶中总黄酮的含量测定：分述如下。

2.2.1 芦丁标准溶液配制：精确称取芦丁标准品，用无水甲醇溶解并定容，配制成每毫升含芦丁0.2mg的芦丁标准溶液。

2.2.2 试样处理：精密量取提取液适量，水定容至25ml。取样0.5ml，置10ml容量瓶中，甲醇加至3.5ml，再加0.5ml亚硝酸钠溶液（5%），混匀，室温放置6min，再加0.5ml硝酸铝溶液（10%），混匀，放置6min，再加5ml氢氧化钠溶液（1%），混匀，用水定容至刻度，放置12min后，以空白溶液为参比，在波长510nm处测吸光度，按标准曲线计算供试品溶液中芦丁的重量（mg）即得。

2.2.3 芦丁标准曲线制备：准确吸取芦丁标准溶液0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5ml，分别置于 10ml容量瓶中，加甲醇至3.5ml，按2.2.2方法显色，以空白溶液为参比，在波长510nm处测定吸光度。以吸光度作为纵坐标，质量作为横坐标，绘制芦丁标准曲线。

2.2.4 乌药叶中总黄酮测定方法学考察：①线性：在0.208～0.728mg质量范围内有较好的线性关系，线性方程为y=1.022x+0.001，线性相关系数R=0.9994。②精密度：取芦丁对照品2.5ml，按法测定吸光度，平行测定5次，计算吸光度RSD=0.21%，该方法精密度较好。③稳定性：取同一批号乌药叶提取物样品1份，按方法处理后间隔一定时间测定吸光度，结果RSD为0.34%，显示4小时内样品稳定。④重复性：取同一批号的乌药叶提取物样品6份，检测总黄酮含量。结果表明平均值为46.89mg/ml，RSD为0.155%，该方法重复性较好。⑤回收率：取重复性样品，平行6份，分别加入适量对照品，按方法检测总黄酮含量，计算回收率。结果表明回收率在95%～102%范围，RSD＜3%，该方法准确度较好。

表5 回收率实验

3 分析与讨论

采用醇提和水提对乌药叶进行提取研究，发现两者均能提取出一定比例的总黄酮，推测黄酮类成分可能以苷类和游离状态同时存在于乌药叶中，经单因素考察确定提取用乙醇浓度为70%，经正交实验确定本实验选用先醇提后水提的方法，可以获得更高的总黄酮提取率。亚硝酸钠-硝酸铝法为中华人民共和国药典常用的检测总黄酮含量的方法，通过考察该方法检测乌药叶总黄酮的线性、稳定性、精密度、重复性和回收率，证明此方法简单可靠，适合乌药叶及其提取物的总黄酮含量检测。