氮、磷供给水平对纤细角毛藻生长及细胞物质组成的影响

周泽鹏，周晓见，2，宋雨晴，刘青，2，靳翠丽，2

（1.扬州大学环境科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.扬州大学海洋科学与技术研究所，江苏 扬州 225127）

微藻通过光合作用将大气中的CO2固定，转化为以碳水化合物为主的有机碳，一方面用于构建微藻细胞结构，扩增微藻细胞形成更大生物量，另一方面以各种复合形式储存化学能和还原力[1]。藻类细胞壁由各种己糖和戊糖直接结合而成，β-1,3 葡聚糖储存光合作用产生的部分化学能和还原力，还有一些还原力和化学能储存在脂类中作为分子池，用作生产细胞所需原材料的替代能源[1-2]。蛋白质构成的碳库，还起到氮储存的作用，并且这个生化参数的变化可以反映细胞生长/分裂的活跃度[1]。研究发现，不同条件下生长的微藻，其细胞物质组成具有一定的差异[3-4]。

微藻细胞内含有丰富的脂类、蛋白质和碳水化合物，使其成为水产养殖中浮游动物、双壳类、蟹类幼虫和鱼类幼体的重要饵料，同时也适用于其他各种商业用途[2]。海洋微藻饵料的培养是海水养殖育苗过程中的重要环节，微藻饵料生物量充足、细胞组成营养丰富是海水养殖育苗中幼体孵育的基本保障。纤细角毛藻（Chaetoceros gracilis）生长速度快、繁殖迅速、容易培养，同时细胞富含多种营养物质，是重要的饵料微藻[3]。该试验研究氮磷供给浓度对纤细角毛藻的影响，对于节约培养成本、扩大纤细角毛藻生物量生产、改善细胞营养组成，进一步提高纤细角毛藻的培养效益具有重要意义。

1 材料和方法

1.1 试验设计与纤细角毛藻培养方法

纤细角毛藻由中国海洋大学教育部海水养殖重点实验室提供，用人工海水配制的Guillard 的f/2培养基保种。

改变氮、磷供给浓度进行试验。氮供给设置7个浓度（NaNO3，μmol/L），分别为110.31、220.61、441.23、882.46、1 323.69、1 764.91 和2 647.37。磷供给设置7 个浓度（NaH2PO4·H2O, μmol/ L），分别为4.01、8.01、16.03、32.05、48.08、64.10 和96.15。其中氮供给浓度882.46 μmol/L 和磷供给浓度32.05 μmol/L与f/2 配方中基准浓度相同，记为1 倍浓度（对照），从低到高依次将上述氮磷供给浓度分别标记为1/8倍、1/4 倍、1/2 倍、1 倍、3/2 倍、2 倍和3 倍基准浓度。纤细角毛藻在250 mL 锥形瓶中进行一次性培养，不充气，每天摇动2 次。在23 ℃、光强100 μmol·m-2·s-1，光∶暗比为12 h∶12 h 的光照培养箱中培养。初始密度为每毫升0.61×106，7 d 后收获。所有试验设置3 个重复。

1.2 纤细角毛藻生长情况测定

用血球计数板计数，再使用酶标仪测定相应细胞密度下藻液在520 nm 下的吸光度（OD520），建立OD520与藻细胞密度间的标准曲线。每24 h 测定藻液的OD520，计算细胞密度[3]。

1.3 纤细角毛藻细胞内蛋白质、总糖和脂肪含量测定

蛋白质和总糖含量测定方法如下，收集30 mL藻液，4 000 r/min 离心10 min，用30 mL 蒸馏水重新悬浮藻细胞成悬液，用冰浴超声（700 w，超声5 s，间隔3 s） 破碎10 min，4 000 r/min 离心10 min，取上清液用于测量蛋白质或总糖含量。采用考马斯蓝法以牛血清白蛋白（BSA）为标准测定蛋白质含量[5]。采用苯酚-硫酸法以D-葡萄糖为标准测定总糖含量[6]。

脂肪含量测定方法如下，收集50 mL 藻液，4 000 r/min 离心10 min，沉淀用蒸馏水洗两次，加入20 mL 甲醇∶氯仿=2∶1（v/v）混合物，剧烈震荡后4 ℃放置过夜。悬液冰浴超声（700 w，超声5 s，间隔3 s）破碎10 min 后，4 000 r/min 离心10 min，取氯仿层加等量蒸馏水摇匀，4 000 r/min 离心10 min，收集氯仿相至烘干并称重的试管中，蒸发溶剂，放置50 ℃烘箱中烘30 min，称重记录[3]。

1.4 统计分析

所有处理均设置3 个重复。数据分析采用IBM SPSS22 软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA），利用最小显著差数法（Least Significant Difference，LSD）或Dunnett T3 进行多重比较，分别用大、小写字母代表极具统计学意义（P≤0.01）和具统计学意义（P≤0.05）的差异[7]。

2 结果

2.1 不同氮磷供给浓度对纤细角毛藻生长的影响

纤细角毛藻在不同氮磷供给浓度的培养基中都能生长（图1-A，1-B），从每毫升细胞数量0.61×106逐渐上升，在1 倍氮磷浓度的培养基（即对照）中，每毫升纤细角毛藻的最终细胞数量在培养7 d时达到8.00×106（图2-A，2-B）。氮供给浓度低于对照时，纤细角毛藻的生长受到抑制，1/8、1/4 和1/2倍氮供给浓度培养基的最终细胞数量都低于对照，1/8 倍氮供给浓度时每毫升细胞数量为4.72×106，只有对照密度的59%。但是氮供给浓度超过对照时，对纤细角毛藻生长的促进作用并不明显，收获时每毫升细胞数量未超过对照。磷供给浓度的变化对于纤细角毛藻的生长也有明显影响，1/8、1/4 和1/2 倍磷供给浓度的每毫升细胞数量都低于对照，1/8 倍磷供给浓度时每毫升细胞数量只有4.29×106，只是对照密度的54%。然而，与氮供给不同的是，提高磷供给浓度能明显促进纤细角毛藻的生长，3/2 倍磷供给浓度下，每毫升细胞数量高达13.41×106，是对照的1.7 倍。磷供给浓度继续升高，促进生长的效果有所下降，但每毫升细胞数量仍远远高于对照，2 倍和3 倍磷供给浓度的最终细胞数量相差不大，都是对照的1.5 倍左右。

2.2 不同氮磷供给浓度对纤细角毛藻细胞物质组成的影响

氮供给浓度对纤细角毛藻细胞内蛋白质含量影响极显著（图3-A）。在低于和等于对照氮供给浓度的范围内，蛋白质含量与氮供给浓度呈现线性相关，氮供给浓度越低，蛋白质含量越低。氮供给浓度超过对照时，细胞蛋白质含量极显著提高（P=0.01），3/2~3 倍氮供给浓度的单个细胞平均蛋白质含量为9.067 pg，而1/8~1 倍氮供给浓度的细胞平均蛋白质含量为2.072 pg，不足前者的1/4。磷供给浓度对于纤细角毛藻的蛋白质含量也有影响，在1/4 和1/2倍磷供给浓度时的细胞蛋白质含量较高，而其他磷浓度下的蛋白质含量均与对照没有统计学意义差异（P=0.05，图3-B）。

氮供给浓度对纤细角毛藻细胞的总糖含量也有影响（图4-A）。对照的单个细胞总糖含量最高，可达2.870 pg，其他氮供给浓度下的总糖含量区别不大。磷供给浓度极显著影响纤细角毛藻的总糖含量（P=0.01），低磷供给浓度有利于细胞积累总糖，高浓度带来总糖含量下降（图4-B）。1/8 至1 倍磷供给浓度范围内，细胞总糖含量较高，平均值为2.519 pg，3/2 到3 倍磷供给浓度范围内的细胞总糖含量较低，平均值只有1.459 pg，只有前者的58%。

氮供给浓度对纤细角毛藻细胞的脂肪含量有显著影响（图5-A）。3 倍氮供给浓度时单个细胞脂肪含量最低，仅17.600 pg，且1/2~3 倍氮供给浓度间的脂肪含量无统计学差异（P=0.05），所以，高氮供给浓度不利于细胞积累脂肪。低氮供给浓度（1/8 和1/4 倍）使纤细角毛藻脂肪含量显著增加（P=0.05），分别是对照的1.8 倍和1.3 倍。磷供给浓度对于纤细角毛藻的脂肪含量也有显著影响，尤其是降低磷供给浓度能显著提高脂肪含量（P=0.05，图5-B）。1/8和1/4 倍磷供给浓度使脂肪含量分别达到55.453 pg和50.571 pg，分别是对照的2.6 倍和2.4 倍。磷供给浓度高于对照，脂肪含量无统计学差异，均不利于纤细角毛藻细胞积累脂肪。

3 讨论

微藻通过光合作用固定二氧化碳，固定的碳如何分配取决于微藻的种类及生长环境条件[4，8-9]。为了提高微藻培养效益，人们采取了许多生物和非生物因素的策略，比如改变温度、盐度和营养盐等，这些因素会导致微藻生长情况和生化成分的变化[10]。营养盐中的氮、磷供给水平是决定微藻生物量生产的重要因素，已被证明是改变微藻质量的有效因素[4，11-12]。氮在微藻生物量中的占比约为7%~10%（w/w），主要以硝酸盐的形式从培养基中吸收，是细胞蛋白质、核酸、磷脂和叶绿素等的基本元素，在微藻生命活动中占有首要地位[13]。磷是微藻3 大必需元素之一，参与微藻各种代谢活动，在细胞膜结构、物质代谢以及信号传导、光合作用等方面都起着极为重要的作用[14]。

该研究结果表明，在提高纤细角毛藻生物量产量方面，改变磷供给浓度比氮更有效。低氮（1/2 倍及以下）使纤细角毛藻的生物量减少严重，而高氮（2 倍、3 倍）培养的细胞密度虽高于低氮，但仍与一倍氮相当，说明通过提高氮供应促进纤细角毛藻生长的意义不大。在该营养水平下，其他因素（如光）可能成为限制因素[15]。低磷（1/8、1/4 倍）使纤细角毛藻生长缓慢，高磷（大于1 倍磷）培养的生长情况明显改善，3/2 倍磷在整个培养过程中的生长状况都明显好于其他培养基。对于氮磷两种营养素来说，3倍浓度在纤细角毛藻的生长方面均不具有明显优势。因此，为了提升纤细角毛藻的生长速度，可以适度提高磷浓度，3/2 倍的磷供给浓度比较适宜。在改善纤细角毛藻细胞营养物质组成方面，高氮（3/2~3倍）是提升细胞蛋白质含量的有效手段，磷浓度变化对于细胞蛋白质含量的影响较低。低磷（1/8~1倍）有助于提高总糖含量。低氮（1/8~1/4 倍）和低磷（1/8~1/4 倍）都能有效提高细胞脂肪含量，其中1/8倍的磷供给浓度对于提高脂肪含量效果最好。

闫爱菊等[16]在纤细角毛藻氮磷比（N/P）的研究中发现，纤细角毛藻在低N/P 水体中的生长好于高N/P 水体，而且当N/P 大于16∶1 时纤细角毛藻生长速率受到抑制。因此认为纤细角毛藻生长受磷供给的影响要大于氮供给的作用。该文的研究结果证明，纤细角毛藻不仅生长速率受磷供给影响大于氮供给，而且对于改变细胞物质组成而言，除了蛋白质含量，调节磷供给浓度比氮更为有效。实际生产中，可调整培养基的氮磷供应水平，达到不同的培养目标。