一例异育银鲫病源细菌的分离、鉴定及药敏试验

张荧荧，刘张淮，朱春艳，王晓英，管杰，王宇哲，王家军

（宝应县水生动物疫病与预防控制中心，江苏 宝应 225800）

异育银鲫（Carassius auratus gibelio）是中国科学院水生生物研究所于1970 年代中后期至1980年代初，利用天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工繁育的一个异精雌核发育鲫鱼养殖品种，由于异育银鲫具有多种养殖优势，在1986 年就已经作为淡水养殖的优良品种而在全国23 个省市得到推广。近年来中科院水生所选育的异育银鲫“中科3 号”、“中科5 号”加快了鲫鱼养殖品种更新的速度，即便如此，异育银鲫养殖过程中病害问题一直存在，近年来渐趋严重，极大影响了养殖异育银鲫的经济效益[1]。

该试验对一养殖塘发病严重的鲫鱼样品进行了病源细菌的分离鉴定，并进行药敏试验，以期为防治鲫鱼常见细菌性疾病提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品

患病鲫鱼采自宝应县广洋湖镇，平均体质量125 g 左右。发病塘口放养鲫鱼密度为每667 m2放养1 600 尾，混养少量花白鲢，4 月初鲫鱼开始发病，出现赤皮、红鳃、水霉病等症状。

1.2 试剂

营养琼脂培养基、营养肉汤培养基；DNA 提取试 剂 盒 ；Protease K、DNA Marker2K、ddH2O 和2 ×EasyTay PCR SuperMix；动物用药敏分析试剂板。

1.3 仪器

洁净工作台、干式恒温器、SHP-160 型生化培养箱、THZ-82B 型空气摇床、MIKRO200R 型台式高速冷冻离心机、S1000 型PCR 仪、BG-Power 600 型电泳仪、INFINITY-3026 型凝胶成像系统、细菌自动鉴定系统。

1.4 病原菌分离

在无菌条件下使用无菌接种针蘸取鲫鱼病灶部位于营养琼脂培养基上，在28 ℃培养箱中培养24 h，进行3 次分离纯化，最终选取3 株优势菌。同时，将分离出的菌落接种于营养肉汤培养基上，于28 ℃空气摇床中过夜培养，保存菌液。

1.5 细菌初步鉴定

观察分离纯化出来的3 株菌株形态，使用细菌自动鉴定系统对分离出的3 株细菌进行初步鉴定。

1.6 DNA 提取

分离菌震荡培养24 h 后，提取细菌DNA，按照DNA 提取试剂盒操作说明。

1.7 16 S rRNA 基因测序和分析

利用细菌16 S rRNA 通用引物进行PCR 扩增。16 S rDNA 引物序列：F（5’-AAACTCAAAGGAATTGA CGG-3’）和R（5’-GACGGGCGGTGTGTACAA-3’），参考彭宣宪等人方法[2]。PCR 反应体系25 μL：SuperMix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，正反向引物各1 μL，模板1 μL。PCR 反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性3 s、56 ℃退火15 s、72 ℃延伸10 s，35 次循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。取一部分扩增产物进行凝胶成像，观察一下片段大小。剩下的PCR 扩增产物送往上海生工生物股份有限公司进行16 S rRNA 基因测序。

1.8 药敏试验

使用动物用药敏分析试剂板检测两种细菌对8种常见抗生素的药物敏感性，药敏结果判定参照《抗微生物敏感试验的执行标准》（CLSI）[3]。

2 结果

2.1 细菌分离

从患病鲫鱼分离出3 株优势菌（图1），菌株在营养琼脂培养基上生长优势良好，分别编号GY-1-2、GY-1-3、GY-2-1。

2.2 细菌生物系统初步鉴定结果

将3 株菌株接种到生化反应板上，放置到28 ℃的培养箱中培养24 h，使用细菌自动鉴定系统进行初步鉴定。结果如表1，初步鉴定GY-1-2 为栖稻黄色单胞菌（Pseudomonas oryzihabitans），GY-1-3 为嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila），GY-2-1 为恶臭假单胞菌（P. putida）。

2.3 16 S rDNA 鉴定

利用细菌16 S rRNA 通用引物进行PCR 扩增，扩增产物的凝胶成像图（图2），片段大小在500 bp左右。将测序获得的基因序列提交BLAST 进行比对，如表2 所示，GY-1-3 与嗜水气单胞菌的基因序列相似度最高，GY-1-2、GY-2-1 与假单胞菌的基因序列相似度最高。结合细菌自动鉴定系统的初步鉴定结果，确定GY-1-2 为栖稻黄色单胞菌,GY-1-3为嗜水气单胞菌，GY-2-1 为恶臭假单胞菌。

表1 细菌生物系统初步鉴定结果

2.4 药敏试验

综合汇总3 种菌的药敏程度（表3），栖稻黄色单胞菌恶臭假单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、盐酸多西环素和磺胺甲恶唑+甲氧苄啶高度敏感。嗜水气单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟 苯尼考和盐酸多西环素5 种抗生素高度敏感。恶臭假单胞菌对恩诺沙星、硫酸新霉素、盐酸多西环素高度敏感。

表2 基因序列相似度

表3 菌株药敏特性

3 讨论

假单胞菌与嗜水气单胞菌广泛分布于自然环境中和水生动物体内，栖稻黄色单胞菌、恶臭假单胞菌属于革兰氏阴性菌，是一种条件性致病菌。恶臭假单胞菌在人体的呼吸道和肠道也有分布，引起人的败血症等。该菌除了感染人之外，对多种水生动物如两栖类、鱼类都有较强的感染性。对不同的水生动物感染恶臭假单胞菌引起的症状与病理变化也有较大的差异[4-6]。该研究中感染的鲫鱼病理症状为肠炎，解剖后腹腔有恶臭的气味。嗜水气单胞菌属于气单胞菌科，气单胞菌属。在池塘水质变化，养殖鱼体体质下降时往往诱发疾病，给水产经济造成损失。嗜水气单胞菌易致鲫鱼赤皮、皮肤溃烂、败血症急性死亡[7-8]。所以如何有效的抑制嗜水气单胞菌与假单胞菌在养殖生产中尤为重要，该研究主要通过分离出的3 组细菌做药敏试验，对比出抗菌效果较好的几种药物，指导养殖户解决了目前鲫鱼大批量死亡的问题。但在实际应用过程中，这些药物可能会受到温度、环境污染物等多方面影响，要因地制宜地使用。当然，长期滥用同一种抗生素药物在消灭细菌的同时也造成耐药性的问题也值得我们重点关注[9]，药物只是起到辅助作用，在养殖过程中，做好预防管理工作才能获得更好的经济效益。