2016～2020年云南部分地区禽腺病毒4型检测分析

朱丽华 王超 宋建领

（1，云南省玉龙县龙蟠乡畜牧产业发展服务中心 674112；2，云南省玉溪市红塔区动物卫生监督所 653100；3，云南省畜牧兽医科学院云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室 650224）

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV) 4 型属于腺病毒科、禽腺病毒属[1]，为无囊膜、双股线性DNA 病毒，外形呈立体对称的二十面体，六邻体蛋白(Hexon)、五邻体蛋白(Penton) 和纤维蛋白(Fiber) 构成腺病毒的外壳蛋白。FAdV-4 为禽腺病毒中致病性最强的[2]，是引起近年来在我国爆发的以心包积液和肝炎为主要特征的病毒性传染病主要病原，给我国养禽业造成巨大的经济损失。该病1987 年巴基斯坦的安卡拉地区首次爆发该病，所以也称为安卡拉病，根据典型的临床特征，又称为心包积液-肝炎综合征。1989 年后该病在世界范围内流行，2013 年在我国散在发生[3]，2015 年在我国大面积爆发[4-6]，2016 年本实验室在云南省石林县肉鸡群首次检测到FAdV-4 病原核酸后，每年分别在云南省昆明市、楚雄周、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区采集样品，进行FAdV-4 流行情况监测，现将2016 年5 月至2020 年4 月份检测结果报道如下。

1 材料

1.1 病料

2016 年5 月至2020 年4 月在云南省昆明市、楚雄州、红河州、玉溪市等家禽养殖密集区采集发病鸡肝脏样品，冷藏送实验室进行检测。

1.2 主要试剂

DNA 核酸提取试剂盒、PCR 试剂盒和DL2000 分子量标准等均购自大连宝生物公司。

1.3 主要仪器

超净工作台（型号为LA2-4A1），购自ESCO 公司；PCR仪（型号为9700），购自美国ABI（Applied Biosystems Inc）公司；凝胶成像系统（型号为2000），购自美国伯乐BIO-RAD公司。

2 方法

2.1 病料处理

将每个养鸡场每次采集的肝脏组织样品混合剪碎，按1:5的比例加入灭菌PBS 研磨，研磨的混合物反复冻融3 次，3000r/min 离心10min，取上清液提取核酸。

2.2 DNA 的提取

按照DNA 核酸提取试剂盒说明书，分别提取上清液的DNA 核酸。

2.3 PCR 检测

根据国内外已发表的FAdV-4 病毒基因序列及相关文献[7]，设计FAdV-4 检测引物FAdVF:5-TGCTCGTTGTGGATGGTGAA-3、FAdVR:5-CTCCGTGTTGGGCTGGTC-3，预期扩增产物564bp。反应条件为95℃、5min；95℃、45s，58℃、45s，72℃、45s，35 个循环；72℃，10min。1.2%琼脂糖凝胶，100V 电泳30min，观察PCR 扩增结果。

3 结果

3.1 样品采集情况

2016 年5 月至2020 年4 月在云南省昆明市、楚雄州、红河州、玉溪市等采集样品290 场次，昆明市、楚雄州、红河州、玉溪市采集样品详细信息见表1。其中土杂鸡样品248 场次，蛋鸡42 场次。

3.2 PCR 检测结果

290 场次样品，FAdV-4 病毒核酸阳性30 场次，阳性率为10.34%，部分阳性样品PCR 产物琼脂糖凝胶结果见图1。2016年5 月～2020 年4 月每年FAdV-4 核酸检测结果表明，2020 年1～4 月FAdV-4 感染率最高，2018 年FAdV-4 感染率最低，FAdV-4 核酸检测阳性详细情况见表2、图2。在昆明市、楚雄州、红河州、玉溪市4 个州市中FAdV-4 感染率最高的是昆明市，FAdV-4 感染率最低的是红河州，不同区域样品病原核酸检测详细结果见表3、图3。检测的290 场次样品中，土杂鸡样品248 场次，FAdV-4 病毒核酸阳性28 场次，阳性率为11.29%，蛋鸡42 场次FAdV-4 病毒核酸阳性2 场次，阳性率为4.76%。

表1 样品采集情况（单位：场次）

表2 样品病原核酸检测结果（单位：场次、%）

表3 不同区域样品病原核酸检测结果（单位：场次、%）

4 讨论

FAdV-4 感染家禽后发病急传播快，临床上主要表现为病鸡精神沉郁、腹泻、消瘦、羽毛蓬松，最后死亡，部分急性病例无明显临床症状突然死亡。剖检变化主要为心包有淡黄色积液，透明清亮或呈胶冻样，肝脏肿大、质地变脆、易碎，有细菌感染的出现肝周炎。2016 年本实验室在云南省石林县肉鸡群首次检测到FAdV-4 病原核酸后，至2020 年4 月，检测290 场次样品，发现土杂鸡和蛋鸡均有感染，但土杂鸡FAdV-4 感染率明显高于蛋鸡感染率，而且土杂鸡感染FAdV-4 后死亡率高于蛋鸡感染的死亡率，这与国内报道肉鸡死亡率在20%～80%之间，蛋鸡死亡率偏低，夏季多发，其他季节也可发生一致[8]。从监测年度看，2016 年首次在云南检测发现FAdV-4后，2017 年云南省家禽FAdV-4 感染率升高后，2018 年和2019 年南省家禽FAdV-4 感染率维持在一个较低水平，2020 年南省家禽FAdV-4 感染率又进一步升高，据调查发现，云南省2018 养禽场开始使用FAdV-4 疫苗免疫，2018 年和2019 年家禽FAdV-4 感染率低，说明FAdV-4 疫苗免疫能很好控制该病的流行，2020 年FAdV-4 感染率又升高，是由于病毒在免疫压力下发生了变异还是由于新型冠状病毒肺炎疫情导致的饲养管理水平降低引起的需要进一步分析。本文检测结果FAdV-4 感染率最高的是昆明市、感染率最低的是红河州，可能与昆明市是云南省交通枢纽相关，是云南省禽蛋、饲料交易的中心城市有关，云南省的首例FAdV-4 感染也是在昆明市发现，红河州在云南省相对处于温度比较高的区域，不利于FAdV-4 的传播有关，未见关于云南省FAdV-4 感染区域差异性的相关报道，因此关于云南省FAdV-4 感染区域性差异的原因有待进一步研究。本文检测到的阳性样品主要集中在30 日龄左右的土杂鸡和开产前蛋鸡群，与报道3～5 周龄的肉鸡和10～20 周龄蛋鸡易感该病一致[9]，对检测到FAdV-4 阳性鸡群，采用高免抗体配合抗生素治疗，都取得比较好的治疗效果。因此，该病的防控措施除了加强饲养管理和生物安全措施执行到位的同时，主要是在疫区进行疫苗免疫，发病鸡群准确诊断后，采取针对性的治疗措施都会取得很好的防控效果。