c-Met通过E-cadherin介导的EMT与宫颈癌进展的相关性研究*

程 云，高 巍，彭景贤，岳淑芬，宋 芳，陈 晶，赵紫薇，杨美霞，韩晓敏

(1.内蒙古科技大学包头医学院组织学与胚胎学教研室,内蒙古包头 014040；2.包头市疾病预防控制中心微生物检验科)

宫颈癌(Cervical cancer)是女性生殖系统中常见的恶性肿瘤，占女性恶性肿瘤发病率位居第二，仅次于乳腺癌，确诊时多数患者已属中晚期，且年轻患者的发病率占比逐年增加。对宫颈癌发生发展机制的探索研究，以及寻找新的治疗靶点已成为近年来宫颈癌领域研究的热点与难点[1-2]。近年来，宫颈涂片细胞学检查及HPV检测等早期筛查技术准确率的提升和检查方法的普及，使多数早期宫颈癌患者得到及时有效的治疗。随着手术、放化疗等治疗方法的不断进步和更新，多种抗肿瘤药物的临床应用，均提高宫颈癌患者综合治疗疗效，改善患者的生存率和生活质量，但肿瘤复发和转移仍是导致宫颈癌患者死亡的主要因素。上皮-间质转化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)是肿瘤迁移浸润及侵袭转移的主要影响因素，肿瘤细胞抑制上皮细胞黏附因子表达，降低细胞间黏附力，降解肿瘤细胞周围的基质，使细胞脱离上皮组织，进而发生侵袭和远处转移。EMT过程中需多条信号传导通路的激活以及多种细胞因子的参与，是一个复杂的由多基因调控的过程。c-met在多种肿瘤中被证实参与EMT过程，且与肿瘤的发生发展有密切联系[3]。原癌基因c-Met是HGF的高度亲和性受体，在正常细胞和肿瘤细胞中均有表达，其持续激活是组织细胞癌变或癌细胞增殖亢进的重要原因。因此，本研究通过分析c-met和E-cadherin在宫颈癌组织中的表达水平变化，及其与宫颈癌患者临床病理特征之间的相关性，探究c-met通过E-cadherin调控介导的EMT参与宫颈癌发生、发展可能的作用机制，旨在为临床诊断及治疗早期宫颈癌提供新的策略。

1 对象与方法

1.1标本采集 选取内蒙古自治区人民医院和包头医学院第一附属医院2015年3月至2017年3月就诊的50例宫颈癌患者的肿瘤组织及癌旁组织(癌旁组织距离肿瘤组织边缘>5 cm)。组织样本取下后立即放于液氮中运输，并于-80 ℃保存。根据术中病理检查确诊肿瘤病理类型，50例宫颈癌患者诊断明确，包括25例鳞癌、20例腺癌及其他类型5例。

1.2临床资料 50例宫颈癌患者年龄35～71岁，平均年龄(56.3±8.7)岁，术前均未行放疗、化疗。根据国际妇产科联盟分期标准(FIGO)进行临床分期，包括Ⅰb-Ⅱa期29例、Ⅱb-Ⅲa期13例、≥Ⅲb期8例[2-3]。本研究经包头医学院医学伦理委员会批准。入组标准：(1)组织样本均为手术切除标本或是活检组织标本；(2)所有患者均经病理确诊为宫颈癌，并经2位病理科医生读片确定分期；(3)收集组织样本的患者不伴有其他慢性疾病或是组织器官的不可控感染；(4)所有入组患者及其家属均签署知情同意书。排除标准：(1)无法取得患者病理组织样本者；(2)不能确诊为宫颈癌患者；(3)不签署知情同意书者。

1.3免疫组化检测 将适量宫颈癌组织和癌旁正常组织置于4 %多聚甲醛固定液中固定48 h后进行常规脱水、透明及浸蜡处理。使用莱卡包埋机进行包埋蜡块，RM2016切片机进行连续石蜡切片，厚度5 μm。石蜡切片置于65 ℃烤箱中过夜，而后梯度脱蜡、水化。水化后的组织切片上滴加3 %过氧化氢溶液以阻断内源性过氧化物酶。切片进行酸性修复，采用预先配置好的柠檬酸盐缓冲液，切片置于液体中，采用微波加热法进行。待修复结束后进行1 %BSA室温封闭30 min，加一抗于4 ℃过夜(c-met：兔抗，abcam，1∶200；E-cadherin，兔抗，abcam，1∶200)。加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1∶200)于组织切片，室温孵育1 h。采用DAB显色后，苏木素染核1 min，进行脱水和中性树脂封片。采用正置显微镜观察切片阳性信号，并进行计数统计。免疫组化结果判读，c-Met在细胞内阳性染色部位为胞膜和胞浆，胞浆内棕黄色颗粒为阳性，E-cadherin在正常宫颈组织中着色部位为胞膜，胞膜表达为阳性。采用半定量积分法判定阳性结果，每张切片随机取5个高倍视野(×400)，计数100个细胞/视野,首先按染色强度计分：无着色：0分，浅黄色：1分，棕黄色：2分，棕褐色：3分，染色强度根据每张片子的背景着色进行对比。再按显色比例评分：显色细胞占总细胞﹤25 %计1分，显色细胞占总细胞25 %～50 %计2分，显色细胞占总细胞51 %～75 %计3分，显色细胞占总细胞﹥75 %计4分。最后以两者乘积得分值作为判定标准：阴性为0分；+为1-4分；++为5-9分；+++为﹥9分。

1.4术后随访 对纳入研究的50例宫颈癌患者出院后进行随访，每2月随访1次，持续2年。定义生存分析的终止事件为随访期间发生死亡或者达最长随访时间点。50例患者中未见失访病例，所有患者均参与生存分析。

2 结果

2.1宫颈癌组织和癌旁组织中c-Met的表达 本研究发现，c-Met在癌旁组织中的表达水平低于宫颈癌组织(P<0.05)，而随着宫颈癌分化程度的加深，c-Met的表达水平呈升高趋势(图1)。

2.2c-Met、E-cadherin的表达与宫颈癌病理特征的相关性 对影响宫颈癌预后的因素进行Spearson线性相关性分析，结果提示肿瘤瘤体直径越大、FIGO分期越高以及存在淋巴结转移均提示宫颈癌患者预后呈负相关(P<0.01)，见表1。

表1 宫颈癌患者预后因素分析

本研究根据宫颈癌病理特征比较发现，c-Met高表达患者中，E-cadherin呈现低表达状态，多存在肿瘤直径>4 cm，淋巴结转移和FIGO分期>Ⅲb的病理特征，而c-Met低表达患者中，E-cadherin呈现高表达状态，见表2。

表2 c-Met、E-cadherin表达与宫颈癌瘤体大小、分期、转移情况

2.3c-Met、E-cadherin的表达与宫颈癌患者预后分析 为进一步分析c-Met、E-cadherin表达水平与宫颈癌患者总体生存率的关系，本研究通过建立Kaplan-Meier和Log-rank分析24个月的随访结果显示，c-Met在肿瘤组织中高表达的宫颈癌患者总体生存率低于c-Met低表达患者(图1-E)，E-cadherin在肿瘤组织中低表达的宫颈癌患者总体生存率低于E-cadherin高表达患者(图1-F)。

3 讨论

本研究检测分析c-Met、E-cadherin在癌旁组织与癌组织中的表达差异。结果显示，c-Met在宫颈癌组织高表达，而E-cadherin在癌组织中低表达。c-Met、E-cadherin与肿瘤直径>4 cm、FIGO≥Ⅲb和有淋巴结转移情况存在均具有相关性。c-met表达低，E-cadherin高表达的宫颈癌患者生存率高。根据结果分析得出，E-cadherin在宫颈癌组织中表达和对患者预后具有一致性，并与c-met呈相反性。E-cadherin作用于细胞的黏附和解离，与宫颈癌的发生发展关系密切。有研究证实，随着宫颈病变逐步进展，c-Met蛋白表达逐渐升高，E-cadherin蛋白表达逐渐下降，肿瘤组织中E-cadherin表达与宫颈癌病变程度呈负相关，而肿瘤组织中c-Met表达与宫颈癌病变程度呈正相关,c-Met可抑制E-cadherin使其表达明显减少并促进宫颈癌患者的转移和发展。同时研究结果显示，c-Met在肿瘤组织中高表达的宫颈癌患者总体生存率低于c-Met低表达患者，E-cadherin在肿瘤组织中低表达的宫颈癌患者总体生存率低于E-cadherin高表达患者，可见E-cadherin高表达，c-Met低表达有利于提高患者总体生存率。

c-Met可激活细胞内多种信号通路，如HGF/c-Met、PI3K-AKT、STAT3、PI3K、ERK和FAK等，促进肿瘤细胞增殖和侵袭迁移等[4-8]。c-Met是肝细胞生长因子(Hepatocyte Growth Factor，HGF)的酪氨酸激酶跨膜蛋白受体，由原癌基c-Met编码，主要存在于上皮细胞表面，具有酪氨酸激酶活性，参与细胞增殖、分化等生命活动的调节[9-11]。HGF/c-Met信号通路在生理情况下，对胚胎发育、组织损伤修复起重要作用；异常HGF/c-Met信号转导与恶性肿瘤发生，尤其是肿瘤细胞的侵袭和转移密切相关[12-14]。据文献报道c-Met在乳腺癌、肺癌、泌尿生殖道癌和大肠癌等许多肿瘤组织细胞中高表达，并且c-Met的表达与多种肿瘤的发生发展、转移和患者预后关系密切[15-17]。HGF/c-Met信号通路持续激活,形成不受调控的HGF/c-Met异常自分泌反馈环，诱导并激活黏附因子、降解细胞外基质、促进细胞运动、细胞增殖、分化、侵袭、血管生成、凋亡、EMT以及癌细胞的发育和进展[18-24]。研究发现，宫颈麟状上皮内瘤变(CIN)3级者c-Met表达高于CIN1和CIN2级者；HPV阳性者c-Met表达高于HPV阴性者，且c-Met与患者的临床预后存在负相关性，故认为c-Met参与宫颈癌的发生发展过程，其过度表达与正常细胞的转化及肿瘤的发生有关[25]。本研究检测癌组织和癌旁组织中c-Met表达发现，癌组织中c-Met高于癌旁组织，且随着宫颈癌分化程度的加深而升高，与肿瘤直径>4 cm、FIGO≥Ⅲb和有淋巴结转移情况存在正相关(P<0.01)，与前人研究一致，证明c-Met参与宫颈癌的侵袭和转移过程。

宫颈癌的发生发展和侵袭转移与EMT过程紧密相关，上皮细胞受某些因素调节后失去极性，细胞间紧密连接和黏附能力下降，获得迁移游走的能力，变成具备间质细胞形态和特性的细胞，这种改变即为EMT。E-cadherin因子属于上皮细胞标志物，E-cadherin表达下降促使肿瘤细胞间黏附力减弱，运动能力增强，促进了肿瘤由原位灶侵入血管并远处转移，其表达水平越低提示上皮表型缺失越为严重，EMT进程越深[26-27]。研究发现c-Met能够调节肿瘤细胞EMT过程的发生，癌组织中c-Met表达上调，促进EMT进程。本研究通过对收集的宫颈癌组织及癌旁正常组织样本进行分析，结果提示宫颈癌组织中c-Met表达升高、E-cadherin表达下降，与文献报道结论相符[28-29]。c-Met在宫颈癌组织中表达升高，且介导EMT促进宫颈癌发展。

最新研究表明，miRNA-1能够通过结合到c-met的3’-UTR区域抑制c-met表达[30-32]。故此推测，c-met表达参与阻碍癌组织EMT进程，及其在宫颈癌患者组织中的表达量变化可能会影响患者生存率。本研究通过对随访结果分析发现，c-Met低表达，E-cadherin高表达时，宫颈癌患者生存率高。

综上所述，本研究证实在宫颈癌组织c-met表达明显上调时，E-cadherin低表达，升高的c-met介导EMT发生，促进癌细胞上皮-间质转换、迁移与浸润，降低癌症患者生存率。对宫颈癌的早诊断、早治疗，可获得较好治疗效果，还可提高患者生存率，某些宫颈癌患者甚至可以治愈。虽然宫颈癌的筛查技术已经广泛应用于临床筛查，但因多种因素影响，仍有部分患者在发现时已处于宫颈癌晚期，出现侵袭转移现象，错过最佳治疗时机，并在后期治疗中无法获得满意疗效。随着对c-Met、E-cadherin的深入研究，发现其可作为肿瘤标志物，且有较好稳定性。本研究通过检验宫颈癌患者癌组织与癌旁组织中c-Met、E-cadherin的表达，确认其在宫颈癌发生发展以及迁移侵袭过程中的作用，为后期研究c-Met、E-cadherin是否可作为宫颈癌检验的肿瘤标志物提供了基础临床数据。但对于检验宫颈癌患者血液中c-Met、E-cadherin的表达情况，以及对宫颈癌迁移侵袭作用的分子机制和调控原理尚需进一步研究分析。