响应面法优化乳双歧杆菌Z-1 高密度发酵培养基

徐显睿 李翠凤 张宗博 李道河 隋勇军 陈政言 张兰威

（1青岛根源生物技术集团有限公司食品实验室，山东青岛 266000） （2青岛诺和诺康实业有限公司，山东青岛 266000）（3中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266000）

乳双歧杆菌具有调节肠道，促进肠道健康，提高免疫力，抑制有害菌生长和预防胃肠疾病等多种生理功能。为了将乳双歧杆菌产业化并用于乳品、保健品和各类功能食品中，通常采用高密度培养方式提高菌体活菌数，获得尽可能高的体积生产率。高密度培养是通过较短的发酵周期和较低的发酵体积，从而降低益生菌产业化成本，加快益生菌相关产品的商业化发展进程，进而提高产品的市场竞争力。因此对于益生菌功能性食品，乳酸菌高密度培养技术极其关键。

乳双歧杆菌Z-1 是一株经筛选具有潜在益生功能的菌株，具有较强的耐胃酸、耐肠液能力和细胞黏附性。本试验对乳双歧杆菌Z-1 的培养基进行系统化分析，优化发酵培养基，以期对乳双歧杆菌Z-1 冻干菌粉的产业化提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

乳双歧杆菌Z-1（Bifidobacteriumlactis Z-1），由青岛根源生物技术集团有限公司食品实验室菌种资源库保藏。葡萄糖、蔗糖、乳糖、大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、柠檬酸铵、牛肉膏、酵母膏、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、吐温80、L-半胱氨酸盐酸盐，均为分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司；胡萝卜汁，福建绿泉食品有限公司；玉米浆，广西百果园果汁有限公司；麦芽汁，烟台麦特尔生物技术有限公司；莫匹罗星锂盐，青岛高科技工业园海博生物技术有限公司；琼脂，北京索莱宝科技有限公司。

改良MRS 液体培养基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氢二钾0.12%、柠檬酸铵0.26%、硫酸镁0.058%、硫酸锰0.005%、吐温80 0.15%、L-半氨酸盐酸盐0.1%。

乳双歧杆菌固体计数培养基：乳糖2%、胰蛋白胨0.5%、大豆蛋白胨1.5%、酵母膏0.3%、牛肉膏0.4%、吐温80 0.1%、L-半胱氨酸盐酸盐0.1%、莫匹罗星锂盐0.005%、琼脂1.5%。

1.1.2 主要仪器设备

YXQ-LS-50SⅡ型立式高压蒸汽灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；SW-CJ-1F 型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；AG050 型，厌氧培养罐：广州雷得生物技术有限公司；SE6001FZH，电子天平美国奥豪斯公司；MEI04E型，分析天平梅特勒托利多公司；PHS-3C 型，pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；LRH-250 型，生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；MX-S 型，旋涡振荡器美国赛洛捷克公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化

将乳双歧杆菌Z-1 接种到改良MRS 液体培养基中，按1%接种量进行活化，经2 次传代，37 ℃恒温培养箱中厌氧培养12 h 获得对数生长期的菌液。

1.2.2 单因素试验优化培养基

将经活化2 代的菌体接种到2%不同碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、1%不同氮源（蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨）、3%不同生长因子（胡萝卜汁、麦芽汁、玉米浆） 的改良MRS 液体培养基中厌氧培养12 h，采用乳双歧杆菌固体计数培养基按GB 4789.34—2016 方法进行活菌数测定。

1.2.3 Plackett-Burman 筛选设计

以1.2.2 优化的增菌培养基为基础，通过Plackett-Burman 设计，从11 种培养基成分中筛选出对乳双歧杆菌Z-1 菌数有显著性影响的因素。

1.2.4 最陡爬坡试验

为更好地建立响应面拟合方程，确定最佳响应值区域，采用最陡爬坡试验近一步确定主要影响乳双歧杆菌Z-1 菌数因素的最优浓度。该试验以

1.2.3 中结果确定各显著因素爬坡方向及步长。

1.2.5 BBD 响应面设计优化增菌培养基

响应面分析采用多元二次回归方程拟合因素和响应值间的关系。通过对乳双歧增菌培养基成分中的显著性影响因素与菌体浓度之间的拟合，优化培养基中的关键成分，获得优化培养基。

1.3 数据处理

采用Design-Expert8.0 软件分析。

2 结果与分析

2.1 碳源的选择

单因素试验结果表明，分别按2%（乳糖和葡萄糖各1%） 添加不同碳源、按1%（蛋白胨和胰蛋白胨各0.5%） 添加不同氮源、按3%（麦芽浓缩汁和玉米浆各1.5%） 添加不同生长因子的增菌效果不同。其中乳糖作为碳源增菌效果最好，培养12 h 活菌数为1.9×109CFU/mL；胰蛋白胨为增菌效果最好的氮源，培养12 h 活菌数为1.53×109CFU/mL；玉米浆为增菌效果最好的生长因子，培养12 h 活菌数为1.84×109CFU/mL。因此选择乳糖、胰蛋白胨和玉米浆为增菌培养基的碳源、氮源和生长因子，20 g/mL 乳糖、10 g/mL 胰蛋白胨和30 g/mL 麦芽汁为响应面试验的因素低水平取值。

2.2 Plackett-Burman 试验

根据单因素试验结果，选取乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氢二钾、柠檬酸铵、硫酸镁、硫酸锰、吐温80、L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆共11 种组分进行N=20 的Plackett-Burman 试验，确定对乳双歧杆菌Z-1 菌量具有显著影响的因素。

采用PB 试验进行因素筛选，采取+1 水平是-1水平的2 倍进行设计。试验设计和响应值及分析见表1、表2 和表3。

表1 PB 试验设计的变量及不同水平的用量

表2 Plackett-Burman 试验设计及结果

表3 PB 试验显著性分析表

由表3 可以看出，根据统计学分析，影响菌量的极显著因素共有4 个，其中磷酸氢二钾贡献率为36.33，硫酸镁贡献率为10.27，L-半胱氨酸盐酸盐贡献为19.70；玉米浆贡献率为28.32。由此得出拟合回归模型方程如下：

菌数Y=72.77-0.87A+1.13B-0.77C-0.27D+6.83E -0.27F+3.63G+0.37H -0.77J+5.03K +6.03L。

由方差分析表可知，模型有统计学意义（F=26.64，P＜0.05），调整R2为0.936 9，说明菌数的变化93.69%是由所选因素引起的。本模型中信噪比值为16.053，说明了模型的充分性和合理性。在所选因素中磷酸氢二钾、硫酸镁、L-半胱氨酸盐酸盐、玉米浆对菌数的影响在0.01 水平有统计学意义，且为正向影响。

2.3 最陡爬坡试验

根据PB 试验，磷酸氢二钾、硫酸镁、L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆均为正效应，故爬坡方向均向上。以磷酸二氢钾方程系数为基准量分别确定各显著因素浓度，具体见表4、表5。

表4 最陡爬坡试验各因素步长水平表

表5 最陡爬坡试验设计及结果

由表5 看出，因素水平在原点+4△处菌量达到最大，之后菌量减少，最大值出现的响应区间在因素水平4 附近，选择因素水平4 作为中心点。

2.4 响应面试验

以磷酸氢二钾、硫酸镁、L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆为自变因素，采用响应面法对最佳培养基进行优化。

2.4.1 响应面试验因素水平及结果

运用Box-Behnken 组合试验设计原理，对磷酸氢二钾（A）、硫酸镁（B）、L-半胱氨酸盐酸盐（C） 和玉米浆（D） 进行四因素三水平响应面分析试验。响应面试验因素水平和结果分别见表6 和表7。

表6 响应面试验因素水平表

表7 响应面试验设计与结果

2.4.2 响应面试验结果及方差分析

利用Design-Expert 软件对试验数据进行分析，得到二次多项回归方程：Y（菌量）=105.99 +3.43A -1.90B +0.68C +1.84D -3.17AB -2.28AC -3.16AD+0.32BC+3.57BD -0.66CD -2.87A2-6.10B2-7.55C2-8.66D2。菌量响应面拟合回归方程的方差分析结果见表8。

由表8 方差分析结果可知，模型F=23.56，P＜0.0001 差异极显著，且失拟项p＞0.05，故说明该模型显著。模型的R2=0.9593，说明拟合程度很好，且R2Adj=0.918 6，R2pre=0.782 7，方差相差很小，说明可信度高，可以用此模型来分析预测最优培养基。

对单因素来讲，磷酸氢二钾、硫酸镁和玉米浆对菌量影响均显著，L-半胱氨酸盐酸盐对菌量影响不显著，各因素对菌量影响程度为A＞B＞D＞C。对于交互作用来说，磷酸氢二钾和硫酸镁、磷酸氢二钾和L-半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾和玉米浆以及硫酸镁和玉米浆交互作用对菌量的影响显著（P＜0.05），硫酸镁和L-半胱氨酸盐酸盐以及L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆交互作用对菌量的影响不显著（P＞0.05），对于模型的二次项来说均显著。

2.4.3 响应面结果及分析

不同因素两两交互作用对菌量的影响结果见图1～图6。

表8 菌量响应面拟合回归方程的方差分析

图1 磷酸氢二钾和硫酸镁交互作用对菌量的影响

图2 磷酸氢二钾和L-半胱氨酸盐酸盐交互作用对菌量的影响

图3 磷酸氢二钾和玉米浆交互作用对菌量的影响

图4 硫酸镁和L-半胱氨酸盐酸盐交互作用对菌量的影响

图5 硫酸镁和玉米浆交互作用对菌量的影响

图6 L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆交互作用对菌量的影响

由图1 可知，磷酸氢二钾和硫酸镁交互作用对菌量影响的等高线图为椭圆形，说明对菌量影响显著。当硫酸镁不变时，随着磷酸氢二钾的增加，菌量呈迅速上升趋势；当磷酸氢二钾不变时，随着硫酸镁增加，菌量呈先上升后下降的趋势。当磷酸氢二钾为3.3 g/L，硫酸镁为1.0 g/L 左右时菌量达到最大值。

图2 反映了磷酸氢二钾和L-半胱氨酸盐酸盐交互作用对菌量的影响，等高线图为椭圆形，说明对菌量影响显著，当L-半胱氨酸盐酸盐不变，随着磷酸氢二钾的增加，菌量先迅速上升后变化平缓；当磷酸氢二钾不变时，随着L-半胱氨酸盐酸盐增加，菌量呈先上升后下降的趋势。当磷酸氢二钾为3.3 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐为2.4 g/L 左右时菌量取得最大值。

从图3 可以看出，磷酸氢二钾和玉米浆间交互作用对菌量的影响与图1 相似，菌量在磷酸氢二钾为3.3 g/L，玉米浆为82.5 g/L 时取得最大值。

图4 反映了硫酸镁和L-半胱氨酸盐酸盐交互作用对菌量的影响，对菌量影响的等高线图近似圆形，说明此因素对结果影响不显著。但当固定一个变量，菌量会随着另一个变量的增大先上升后下降，但随着因素值的改变，菌量变化不是很明显。当硫酸镁为1.0 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐为2.48 g/L时菌量最高。

由图5 可知，硫酸镁和玉米浆交互作用对菌量影响的等高线图为椭圆形，说明影响显著，随着因素的增加，菌量上升，在硫酸镁为1.0 g/L，玉米浆为82.5 g/L 左右达到最大值，然后菌量出现下降。

图6 为L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆交互作用对菌量的影响，等高线图为圆形，说明对菌量的影响不显著，在L-半胱氨酸盐酸盐为2.48 g/L，玉米浆为83.0 g/L 取得最大值。

由图1～图6 可知，响应面图均为开口向下的凸面，故响应值R 存在极大值，为进一步优化结果，根据Design-Expert 软件得出在磷酸氢二钾、硫酸镁、L-半胱氨酸盐酸盐和玉米浆交互影响下，菌量最优条件为：磷酸氢二钾3.228 g/L，硫酸镁0.972 g/L，L-半胱氨酸盐酸盐2.451 g/L，玉米浆81.298 g/L，在此条件下模型预测的菌量107.329×108CFU/mL。在37 ℃条件下恒温培养12 h，实际菌量为104.67×108CFU/mL，因此该模型可较好预测乳双歧杆菌Z-1 的生长情况。

3 结论

乳双歧杆菌作为最典型的具有益生功能的菌株，在益生菌产品市场中应用极其广泛。对乳双歧杆菌Z-1 发酵菌数影响最显著的因素为磷酸氢二钾和硫酸镁。矿物质盐具有促进细胞分裂的作用，Caterine 等指出镁离子、钾离子和钙离子能促进乳酸杆菌的增殖，是乳酸菌增殖必需的生长因子。玉米浆富含多种氨基酸、多肽类和维生素，并且含有还原糖及钾、镁、钙、磷等矿物元素。研究表明，维生素可以提高菌体代谢途径中的磷酸果糖激酶活性，促进乳酸菌的生长代谢，还可以降低菌体在培养过程中的死亡率。此外，乳酸菌可直接利用氨基酸，而多肽类则由细胞内的肽酶水解成为游离氨基酸被菌体利用。Etoh 等发现多肽类可显著促进双歧杆菌的生长，与本试验结果一致。L-半胱氨酸盐酸盐是乳双歧杆菌生长最重要的氨基酸，但试验结果显示增菌效果相对不显著，可能与培养基中L-半胱氨酸盐酸盐的含量有关。但在交互作用中，磷酸氢二钾与硫酸镁、磷酸氢二钾与L-半胱氨酸盐酸盐、磷酸氢二钾与玉米浆、硫酸镁和玉米浆增菌效果均得到加强，表明矿物质盐对于高密度培养基至关重要，L-半胱氨酸盐酸盐与玉米浆交互作用对菌数不显著，可能与培养基中两者的添加量较多有关。

通过单因素试验、PB 试验、最陡爬坡试验及响应面设计得出乳双歧杆菌Z-1 最优培养基组成为：乳糖2%、胰蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氢二钾0.322 8%、柠檬酸铵0.26%、硫酸镁0.097 2%、硫酸锰0.005%、吐温80 0.15%、L-半胱氨酸盐酸盐0.245 1%、玉米浆8.129 8%。