基于微流控阻抗传感器检测番茄环斑病毒

李 琛，许庆铎，边 勇

（1. 中国计量大学质量与安全工程学院，杭州 310018；2. 中国海关科学技术研究中心，北京 100026）

0 引 言

近年来，随着中国对外贸易持续扩大、国际旅游更加便捷及跨境电商不断发展，中国国门生物安全形势日趋严峻。外来有害生物的数量和种类出现前所未有的增加，危害着中国农业、生态环境，乃至破坏经济、社会的稳定，威胁国家安全。番茄环斑病毒（Tomato Ringspot Virus，ToRSV）作为一种重要的作物病原体，能够感染大豆、番茄、烟草、葡萄、苹果等 150 多种农作物，导致严重的病害[1-2]。目前，ToRSV 已成为中国禁止入境的Ⅰ类检疫性病毒[3]。

国内外检验 ToRSV 的常用方法是聚合酶链式反应PCR。如赵文军等[4]采用荧光 RT-PCR 在 2 h 内实现了ToRSV 的检测；余澍琼等[5]在PCR 的基础上采用逆转录环介导等温扩增技术（RT-LAMP）检测出ToRSV，相比荧光 RT-PCR 缩短了近一倍时间；易汪雪等[6]采用多重RT-PCR 检测大豆种子中的ToRSV，得到0.58μg/mL 的低检出限。基于 PCR 的检测方法能够实现 ToRSV 的有效准确检测，但设计特异性引物、扩增测序等操作需要专业人员进行，不适用于现场的快速检测[7]。近年来备受关注的微流控技术则能够很好的弥补这一不足。微流控技术将病毒富集、捕获、检测、分析等过程集成到一块几平方厘米的芯片中[8-10]。1992 年，Manz 等[11]在玻璃上设计微通道，从而开创了微流控技术，Gomez 等[12]基于微流控技术集成制造了第一个白金叉指阵列电极的硅基微流控芯片，结合阻抗法研究细胞的代谢活性。近来，微流控技术与电化学阻抗检测方法结合的微流控阻抗传感器愈来愈多应用于生物检测，且方法创新多样，如基于微叉指阵列电极[13-14]、基于介电泳技术（Dielectrophoresis，DEP）[15-16]和基于纳米材料（如纳米粒子[17-18]、纳米孔膜[19-20]和石墨烯[21]等）。不同纳米材料联用产生的协同效应使得微流控阻抗传感器在高效捕获病菌病毒和放大阻抗信号方面的优势更为显著[22]，成为近来微流控阻抗传感器在生物检测领域的研究热点。总之，微流控阻抗传感器具有快速性、特异性、试剂消耗少、无标记检测、操作简便和易于微型化和自动化的仪器设备开发的特点，是实现生物病毒现场检测的理想方法[23-25]。本文针对ToRSV 的检测问题，设计制作了嵌有金叉指阵列微电极的微流控芯片，搭建了面向ToRSV 检测的微流控阻抗传感器检测平台，根据电化学检测原理得到阻抗谱，利用等效电路阐释阻抗产生及变化机理，并进行特异性检测试验。最后，建立ToRSV 浓度和阻抗之间的定量关系模型，为ToRSV 的现场检测提供了理论依据和技术支撑。

1 微流控阻抗检测原理及方法

1.1 微流控阻抗检测原理

微流控阻抗检测技术是基于微流控芯片系统，将生物病毒浓度转换为电化学阻抗信号并进行快速检测的方法，其检测原理是以微流控芯片系统为平台，首先将生物病毒抗体分子固定在微流控芯片中的导电换能器（金叉指阵列微电极）表面，然后将生物病毒的抗原溶液注入到介观尺度的微流道中，病毒抗原抗体在微流道内发生反应后形成特异性复合物并附着在导电换能器上，使得导电换能器的阻抗特性发生变化。因此，建立阻抗信号的变化情况和检测物浓度之间的定量关系以达到检测的目的[26]。

1.2 番茄环斑病毒样本溶液制备

1）先于1.5mL 离心管中加入500μL 植物蛋白提取液A、4μL 蛋白稳定剂和2μL 蛋白酶抑制剂（以上试剂来自植物蛋白提取试剂盒C500053，生工生物工程（上海）股份有限公司生产），用恒温混匀仪（型号 MSC-100，杭州奥盛仪器有限公司）混匀备用；

2）往研钵中倒入液氮，加入带番茄环斑病毒的植物叶片研磨充分，装入上述备好的1.5 mL 离心管中；

3）将离心管放入4°混匀仪中，速度800 r/min，振荡 1 h，随后放入 4°冷冻离心机（型号 5418R，德国Eppendorf 公司）中，速度12 000 r/min，离心15 min；

4）提取离心管中的上清液到一个新的1.5 mL 离心管中，取1μL 分离的上清液，使用超微量分光光度计（型号Nanodrop 2000，美国赛默飞公司）测定番茄环斑病毒浓度为26.6 mg/mL，用磷酸盐缓冲液PBS（0.1 mol/L，pH 值 7.4）分别稀释至 10、1、0.1、0.01 和 0.001μg/mL，于-80°保存备用。

1.3 微流控阻抗检测芯片和系统

本文设计的微流控阻抗检测芯片分为三层：基底层、通道层和盖片层，如图1 所示。

图1 微流控芯片示意图Fig.1 Schematic of microfluidic chip

基底层采用玻璃材质，并在玻璃基底表面通过磁控射频溅射法喷射Cr 层，其厚度为10 nm，用以提高金箔与玻璃的粘结效率[27]；在Cr 层表面再喷射金箔层，其厚度为100 nm，并采用湿法蚀刻技术雕刻出微叉指阵列电极的图案。 通道层采用聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）材质，并利用SU-8 阳膜刻蚀出介观尺度的微流道；通道层包括微通道、储液池和废液池，微通道与金叉指电极在同一空间内形成微反应室，抗体与抗原免疫结合及电极检测阻抗信号均在该区域进行。盖板层采用PDMS 材质，将其覆盖在通道层之上，保障反应空间的密封。

金叉指阵列微电极设计图如图 2 所示，其设计参数为：金叉指微电极对数20 对、电极高100 nm、长0.6 mm、宽 15μm、电极间距 15μm。微通道的设计参数为：长7 mm、宽0.5 mm、深100μm；储液池和废液池的参数为：直径 3 mm，深 100μm；微反应室的体积为：1.2 mm×0.5 mm×0.1 mm=0.06 mL。在盖片层对应储液池和废液池的中心打孔，直径为0.5 mm，连接导管用于试剂的输入和排出。

图2 金叉指阵列微电极设计图Fig.2 Schematic of gold interdigital microelectrodes

微流控芯片阻抗检测系统示意图如图 3 所示，主要包括驱动模块、反应模块和检测模块。驱动模块为微量注射泵（型号Harvard，美国Harvard Apparatus 公司），注射泵通过直径为0.5 mm 的钢针和软导管与微流控芯片的入口相连，以便将病毒检测样品及相关试剂按规定速率注入微流控芯片中；反应模块包括微流控芯片、金叉指电极，为样品从捕捉到免疫反应过程中现象的产生，以及阻抗变化信号产生提供反应平台；检测模块包括电化学工作站（型号 CS350，武汉科斯特科技有限公司）和计算机，电化学工作站与微流控芯片的金叉指微电极连接，对金叉指电极上产生的阻抗变化信号进行检测，数据通过计算机配套软件进行分析。

图3 微流控阻抗检测系统示意图Fig.3 Schematic diagram of the microfluidic impedance detection system

1.4 试验方法

将注射泵注入流速设定为10μL/min，电化学工作站阻抗测试参数设定为：交流激励电压为100 mV，测试频率为1～100 kHz。按照下列步骤进行试验：

1）裸电极测量：注入PBS 缓冲液测量裸电极的阻抗值，测量完成后持续注入超纯水3 min 清洗微通道及微电极；

2）抗体固定：注入 15μL 浓度为 0.5 mg/mL 的 ToRSV单克隆抗体（GenScript USA Inc 生产）使之充满微通道，静置2 h。此时，PBS 缓冲溶液的pH 值为7.4、离子浓度为0.1 mol/mL，该条件下的PBS 缓冲液具有盐平衡和稳定 H+的作用，抗体蛋白在吸附过程中不会受 pH 和离子浓度的影响，从而会被稳定地非特异性吸附在金电极表面。因此，在此条件下蛋白对固体材料的吸附性较好，抗体会被非特异性地吸附在金电极表面。2 h 之后用超纯水清洗除去未吸附的抗体，注入PBS 缓冲液测量阻抗值，测量完成后重复清洗操作。

3）BSA 封闭：注入15μL 1%BSA 溶液（北京索莱宝科技有限公司生产），静置30 min，其作用为封闭未被抗体附着的金电极表面，以免产生多余的干扰信号。30 min 后清洗掉多余的BSA，注入PBS 缓冲液测量阻抗值，测量完成后重复清洗操作。

4）ToRSV 检测：注入 15μL 的 ToRSV 样品，静置30 min，测量阻抗值，测量完成后重复清洗操作，直至阻抗与裸电极测量时相似。

2 结果与分析

2.1 阻抗值与相角分析

利用CS350 电化学工作站在1～100 kHz 的频率范围内测得50 个点的阻抗值和相位值，得到如下阻抗与检测频率以及相角与检测频率关系曲线，如图4 所示。

图4 不同溶液的阻抗(Z)-频率(f)、相角-频率(f)曲线Fig.4 Impedance(Z)-frequency(f) and phase angle-frequency(f)curves of different solutions

图4 为不同阶段的阻抗-频率、相角-频率关系曲线。图4a 中，检测频率范围为1～105Hz，分别测得裸电极、抗体固定、BSA 封闭电极等不同阶段、不同病毒浓度对应的阻抗值。由于检测频率对阻抗的影响，阻抗-频率呈现如下趋势：在1～103Hz 的低频范围内，阻抗值随着频率的降低逐渐趋于平稳；在1 ～100 kHz 的高频范围内，阻抗值随着频率的降低呈线性增加的趋势，并且各步骤下所测的阻抗值大小并无明显区别。此外，相比于裸电极而言，在对单一PBS 缓冲液、抗体固定后以及BSA 封闭电极后的电极阻抗进行测量时发现，电极阻抗进一步提高，说明抗体成功固定在电极表面，且BSA 成功封闭电极中的裸露区域；当抗体捕获ToRSV 并发生反应后，使得电极阻抗值进一步增加，且ToRSV 浓度越高，阻抗值增幅也越大。阻抗值增加的原因是由于电极表面的抗体免疫结合病毒抗原，导致电极指间离子流动和电子转移受阻，且病毒浓度与阻碍能力成正比，病毒浓度越高，离子流动和电子转移能力受阻程度越大，因此导致电极阻抗增加。

图4b 检测频率的范围为1～105Hz，在裸电极、抗体固定、BSA 封闭电极等不同阶段时，不同病毒浓度的相角变化曲线。相位角为-90°时说明该体系是纯电容体系，相位角为0°时说明该体系是纯电阻体系[28]。如图4 所示，在低频范围内（1～103Hz）相位角最低为-10°至-40°，在高频范围内（1 ～100 kHz）相位角最高能接近-90°，说明阻抗的产生在高频区由容抗（电容特性）占主导，在低频区由阻抗（电阻特性）占主导。

2.2 等效电路

2.2.1 等效电路的建立

为了更好地分析高、低频区下的电化学阻抗谱，建立了面向ToRSV 检测的等效电路模型。等效电路模型如图5 所示，包括：溶液电阻（Rs）、电子转移电阻（Ret）、双电层电容（Cdl）和介电电容（Cdi）。当电极浸入电解液中时，电极表面与溶液表面如同电容极板，同时在电极表面产生两层电荷，从而构成双电层电容Cdl，双电层电容Cdl表征离子对电极、溶液界面处电容的影响；电子转移电阻Ret表征电极表面上电子转移到溶液时生成的电阻；双电层电容Cdl与电子转移电阻Ret并联，表征金叉指电极表面与溶液之间的界面所形成的阻抗。Rs表征测试溶液电阻，与双电层电容Cdl和电子转移电阻Ret的并联电路串联；Cdi表征测试溶液的介电电容，与溶液电阻Rs、双电层电容Cdl和电子转移电阻Ret的电路并联。

图5 等效电路图Fig.5 Diagram of equivalent circuit

2.2.2 等效电路的拟合

采用 ZView 电化学阻抗分析软件建立等效电路模型，并利用复杂非线性最小二乘法，对50 个数据点进行等效电路拟合，拟合采用Levenberg-Marquardt 迭代拟合，得到的拟合曲线为公式（1）、（2）。在拟合值与实测值的比较中发现，不同浓度的拟合曲线和实测点值切合度较高，因此选取10μg/mL 浓度病毒抗原的阻抗值和相角实测数据与等效电路拟合曲线加以分析该等效电路的有效性，如图 6 所示。拟合曲线和实测曲线比较可得，阻抗值的误差绝对值的平均值为 0.8%，最大误差为11.9%；相角的误差绝对值的平均值为0.7°，最大误差为5.5°。依次对浓度为 1、0.1、0.01 和 0.001μg/mL 的病毒抗原进行实测试验与拟合试验，阻抗值误差绝对值的平均值分别为0.6%、1.1%、1.2%、0.5%，相角拟合误差绝对值的平均值分别为 0.8°、0.8°、0.5°、0.8°、1.4°。试验结果表明，拟合曲线的拟合效果良好，本文设计的等效电路模型与微流控阻抗传感器具有较好的拟合一致性。

图 6 10 μg·mL-1 ToRSV 阻抗、相角拟合图Fig.6 Fitted curves of impedance and phase angle of 10 μg·mL-1 ToRSV

等效电路中的 2 条支路Rs+Ret+Cdl和Cdi在2 个不同的频率范围内控制着电流的流动。在低频区（1～1 kHz），施加的电压频率不足以使电流通过病毒外壳的脂膜，因此捕获的病毒相当于绝缘体。等效电路中相当于电流不经过介电电容Cdi这条支路，介电电容Cdi不做功，阻抗的产生由Rs+Ret+Cdl支路占主导，其阻抗值计算符合公式（2）。在高频区（1 ～100 k Hz），施加的电压频率足以使电流通过病毒外壳的脂膜，从而电流流经Cdi支路，此时Rs+Ret+Cdl支路不做功，阻抗的产生由Cdi支路占主导，其阻抗值计算符合公式（3）。

电子转移电阻与双电层电容Ret∥Cdl的并联元件阻抗值计算符合电阻和电容并联时的阻抗计算公式[29]

式中Z1表示低频区内由Rs+Cdl+Ret支路所产生的阻抗，Ω；Z2表示高频区内Cdi支路所产生的阻抗，Ω。

2.2.3 等效电路元件对阻抗值的影响分析

为了研究阻抗变化机理，本文对等效电路各元件对阻抗值的影响进行模拟。等效电路元件在不同检测工况下的模拟值如表1所示，同时将BSA封闭电极后检测PBS缓冲液的实验作为阴性对照组。

表1 不同等效电路各元件模拟值Table 1 Analog values of each component with different equivalent circuits

由表 1 可得，与对照试验相比，当病毒浓度增加至10μg/mL 时，溶液电阻Rs从 200.71 增加到 559.78 kΩ，变化量为359.07 kΩ，较对照值200.71 kΩ 相比，变化率为178.9%；电子转移电阻Ret从67.23 增加到251 kΩ，变化量为183.77 kΩ，变化率为273.3%；双电层电容Cdl从194.03 减少到31.22 nf，变化量为-162.81 kΩ，变化率为了-83.9%；溶液介电电容Cdi的变化量为-0.09 nf，变化率为-3.2%。

在高频区，阻抗的产生主要由溶液介电电容Cdi占主导，而溶液介电电容Cdi的值基本不变，在低频区，虽然双电层电容Cdl随着捕获病毒浓度增加而减少，其平均阻抗变化值约38.9 kΩ，约占总阻抗值变化的7.2%，表明双电层电容的变化对阻抗值的变化有微小的影响。溶液电阻Rs和电子转移电阻Ret随着捕获病毒浓度增加而显著增加，且占总阻抗值变化的92.8%，表明阻抗的变化由溶液电阻Rs和电子转移电阻Ret占主导作用。造成溶液电阻Rs及电子转移电阻Ret增加的因素是一致的，即：ToRSV抗体捕捉病毒，使电极表面与溶液交界处、电极指间电子转移和离子流动受阻。

2.3 ToRSV 浓度检测

ToRSV 检测浓度由某一检测频率下的阻抗响应关系决定，选择合适的检测频率能够得到较好的阻抗响应，从而优化传感器的检测灵敏度。在相邻频率梯度内，阻抗差值越大则表明检测频率越佳。

图7 为各病毒浓度的平均阻抗差值∆Z变化曲线，∆Z是基于3 次重复测试下病毒样品的阻抗值减去阴性对照试验所测的阻抗值计算均值所得。∆Z的变化具有相同的趋势：在低频区内（1～1 kHz），∆Z先增加后减少，最大平均阻抗差值落在10.7 Hz 频率上，且该频率下各相邻浓度之间∆Z的变化幅度也最大；在高频区内（1～100 kHz），∆Z几乎重合且接近于0；综上认为10.7 Hz 是本文设计的微流控阻抗传感器检测ToRSV 的最佳检测频率。

图7 不同浓度病毒的阻抗差值Fig.7 Variation of impedance of different concentrations of virus

图8 显示了在最佳检测频率10.7 Hz 时各病毒浓度与阻抗值Z的对应关系，在0.001～10μg/mL 病毒浓度范围内，病毒浓度C和阻抗值Z可表达为

检测限设为空白信号+3 倍信噪比，其中噪声定义为控制对照组的标准偏差，得到此微流控阻抗传感器的检测限为0.003 4μg/mL，对应的阻抗值为307.05 kΩ。

图8 最佳检测频率（10.7 Hz）下的浓度-阻抗关系Fig.8 Concentration-impedance at the optimal detection frequency

表2 总结了番茄环斑病毒ToRSV 的其他检测方法，相比之下，基于微流控阻抗传感器检测ToRSV 具有快速、简便和高灵敏度的优势。

表2 ToRSV 的检测方法比较[30-32]Table 2 Comparison of ToRSV detection methods

2.4 特异性检验

本文使用南方菜豆花叶病毒（Southern Bean Mosaic Virus，SBMV）、南芥菜花叶病毒（Arabis Mosaic Virus，ArMV）和烟草环斑病毒（Tobacco Ringspot Virus，TRSV）作为非靶向病毒来验证 ToRSV 的检验特异性。分别对10μg/mL SBMV 溶液、10μg/mL ArMV 溶液、10μg/mL TRSV 溶液和 10μg/mL 混合 SBMV、ArMV、TRSV、ToRSV 4 种病毒的溶液进行3 次重复检测试验，仍以BSA封闭电极后测PBS 缓冲液的阻抗作为阴性对照得到阻抗差值。

图9 不同病毒的阻抗差值Fig.9 Variation of impedance of different viruses

不同病毒的阻抗差值图如图9 所示，混合4 种病毒溶液的阻抗差值与 ToRSV 溶液的阻抗差值接近；而同浓度SBMV 溶液、ArMV 溶液和TRSV 溶液的阻抗值接近于对照组，与 ToRSV 溶液阻抗值相差较大。试验结果表明：本文设计的面向 ToRSV 检测的微流控阻抗传感器能够从ToRSV 单一溶液及含有ToRSV 的多种混合溶液中检测出ToRSV，同时对其他病毒检测无效。因此，证明了该传感器对 ToRSV 具有较好的检测特异针对性和有效性。

3 结 论

1）本文设计了一种面向 ToRSV 检测的微流控阻抗传感器。将ToRSV 抗体固定于微流控芯片流道中的金叉指阵列微电极表面，通过抗体与ToRSV 的免疫结合引起阻抗变化，并构建电化学阻抗谱；

2）针对阻抗产生及变化机理的研究，提出了一种新的面向ToRSV 检测的等效电路模型，并对浓度为1、0.1、0.01和0.001μg/mL 的病毒抗原分别进行实测试验与拟合试验，阻抗值平均误差分别为0.6%、1.1%、1.2%、0.5%，相角拟合平均误差分别为 0.8°、0.8°、0.5°、0.8°、1.4°，证明了等效电路模型与所设计的微流控阻抗传感器具有较好的拟合一致性。

3）利用阻抗差值显著性区分最佳频率的方法，确定了ToRSV 浓度检测的最佳频率为10.7 Hz，建立了ToRSV浓度C与阻抗值Z的计算模型，并对检测特异性进行检验。试验结果表明，所设计的微流控阻抗传感器检测限为0.003 4ug/mL，且具有较好的检测特异性和有效性。