冻融长期冷冻保存胚胎对妊娠结局的影响

芦亚琼，何钰辉，王 芳，柳胜贤

(郑州大学附属洛阳中心医院生殖中心，河南 洛阳 471000)

目前，随着我国“二孩”政策的实施，在生殖中心接受过体外受精一代(in vitro fertilization，IVF)或二代试管婴儿(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)治疗且有多余冷冻胚胎的家庭对“二孩”需求较为明显。随着胚胎冷融技术的发展，累积妊娠率也随之显著提高[1]。目前国内冷冻胚胎最长且成功分娩健康胎儿的时限为16.8年，然而长期冷冻胚胎的使用安全性依然缺乏明确的临床证据。2018年冷冻胚胎保存时限的中国专家共识指出胚胎冷冻保存6年内不影响胚胎复苏后存活率、着床率、妊娠率、活产率及子代出生缺陷率；建议胚胎冷冻保存期限不超过10年[2]。胚胎冷冻时间超过6年对冻融胚胎移植(frozen embryo transfer，FET)安全性是否有影响尚无足够证据证实[3]，长期冷冻胚胎的妊娠结局目前仍存有争议。

1资料与方法

1.1研究对象

收集在洛阳市中心医院生殖中心行IVF/ICSI后，于2017年1月至2018年12月解冻移植且胚胎冷冻保存时间超过6年的病例为长期冷冻保存组，入选患者有28个周期77枚胚胎，长期冷冻保存组纳入的病例均至少有一次新鲜移植周期或解冻周期的成功分娩史；另收集该时间段解冻移植周期胚胎冷冻保存时间为3～5年的病例作为短期冷冻保存组，入选患者有125个周期264枚胚胎。所有研究对象都签署了知情同意书。

1.2胚胎冷冻与解冻

新鲜取卵周期冷冻策略为：正常受精后第三天(D3)获得的最佳胚胎选择冷冻或者移植2枚，D3冷冻胚胎均为4～9细胞Grade评分Ⅰ级或Ⅱ级，按照Istanbul consensus标准评分。入选的患者胚胎冷冻包括两种方法：慢速程序化冷冻和快速玻璃化冷冻。前者选用Quinn’s成品胚胎冷冻液，冷冻液成分为：1.5M(mol/L)丙二醇+0.1M蔗糖+12mg/mL人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)，1.5M丙二醇+12mg/mL HSA，含有12mg/mL HSA的冷冻缓冲液。程序化冷冻对应的解冻试剂应用Quinn’s成品胚胎解冻液进行解冻，解冻液成分包括：0.5M蔗糖+12mg/mL HSA，0.2M蔗糖+12mg/mL HSA，含有12mg/mL HSA的解冻缓冲液。后者选用加藤冷冻及解冻试剂，按说明书步骤进行操作。

有研究指出慢速程序化冷冻和快速玻璃化冷冻这两种方法对临床结局无明显影响[4-6]，但快速玻璃化冷冻方法操作方便。2012年以来本中心已普遍采用玻璃化冷冻方法，因此分布的差异不具有参考价值。

1.3子宫内膜准备

复苏周期的方案均为人工周期。

1.4统计学方法

2结果

2.1两组患者基本资料的比较

长期冷冻保存组纳入28个周期，新鲜周期冷冻胚胎289枚，解冻胚胎77枚，解冻且存活胚胎74枚，移植胚胎50枚；其中共有3个解冻周期胚胎养囊胚移植，该3个解冻周期的13枚胚胎养成3枚囊胚。短期冷冻保存组纳入125个周期，冷冻胚胎884枚，解冻胚胎264枚，解冻且存活257枚，移植胚胎232枚。两组取卵周期及解冻周期女方年龄、解冻周期子宫内膜厚度比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；不孕类型、受精类型、剖宫产史的差异比较也均无统计学意义(均P>0.05)；两种冷冻方法分布比较差异有统计学意义(P<0.05)。纳入的两组基本资料见表1。

表1 两组研究对象的基本资料比较结果

2.2两组解冻移植周期临床结局的比较

本中心近三年(2016年至2018年)总体解冻复苏率为98.90%(6 616/6 689)，临床妊娠率、种植率、流产率及活产率分别为49.62%(1 703/3 432)、34.47%(2 239/6 495)、19.26%(328/1 703)、37.88%(1 300/3 432)。

两组解冻移植周期的复苏率及临床妊娠率比较差异均无统计学意义(均P>0.05)；长期冷冻保存组的流产率高于短期冷冻保存组，而活产率低于短期冷冻保存组，差异均有统计学意义(均P<0.05)；两组分娩孕周及活产的新生儿体重比较差异均无统计学意义(均P>0.05)，此外两组子代均无出生缺陷。冻胚移植临床结局情况见表2。

表2 两组冻胚移植的临床结局比较结果

3讨论

3.1冻存胚胎策略的现状

胚胎冻融技术有效地提高了取卵周期胚胎的利用率和累积妊娠率，降低了患者的治疗费用；全胚冷冻保存可有效降低卵巢过度刺激综合征(ovarian hyperstimulation syndrome，OHSS)的发生率，从而提高了辅助生殖技术(assisted reproductive technology，ART)治疗的安全性[7]。有大样本数据指出，FET与新鲜胚胎移植的临床妊娠率没有明显差异[8-9]，但FET周期较控制性超促排卵(controlled superovulation，COS)鲜胚移植周期，子宫内膜发育和内膜准备控制的更精细，可形成更好的内膜容受性，因此有研究提出实施常规COS全胚冷冻方案[10]。

3.2长期冻存胚胎对临床结局的影响

随着冷冻胚胎数的不断增多，由此出现不少胚胎冷冻保存数年而无人问津。有报道胚胎冷冻时限超过10年解冻移植成功分娩的案例[11-12]。快速玻璃化冷冻已代替慢速程序化冷冻方法，但快速玻璃化冷冻依然会引起胚胎复苏发育阻滞，高浓度玻璃化保护剂可能对FET子代健康产生负面影响，虽已有证明FET可获得健康婴儿[13-14]，但也有学者提出胚胎冷冻时间过长有可能影响基因的稳定性，造成胚胎DNA碎片的增加、线粒体DNA的突变等[15]，进而对胚胎的活力、种植能力及长期安全性造成影响。FET的长远安全性仍需要大数据的临床观察及妊娠随访结局去验证。

本研究对我中心2010年至2015年冷冻胚胎解冻移植的数据进行统计分析，发现胚胎冷冻保存年限超过6年的解冻复苏率及临床妊娠率较胚胎冷冻时限3～5年的比较差异无统计学意义，但长期冷冻保存组的流产率较高，且活产率较低，提示胚胎冷冻保存年限超过6年可能会对胚胎的发育产生不良影响，进而导致不良的妊娠结局；而长期冷冻保存组新生儿体重及出生时的孕周与短期冷冻保存组比较均无明显差异，提示长期冷冻保存过程可能对胚胎早期发育潜力有不利的影响，对妊娠中后期的胎儿发育无明显影响，但影响胚胎发育机制尚需动物实验及长远临床随访数据深入探讨并验证。