猪粪中嗜热纤维素降解菌的筛选及其除臭特性研究

沈 琦，孙 宏，王 新，吴逸飞，姚晓红，李园成，汤江武

（浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，浙江杭州 310021）

中国是农业大国，但我国农业废弃物数量巨大，且未得到合理利用[1]。畜禽粪便、农业秸秆等废弃物含有大量纤维素，由于木质纤维素结构复杂，相邻的多糖链通过氢键形成高度有序的结晶结构，使降解难度增加，因此农作物纤维素难以得到充分利用。

纤维素的降解利用离不开微生物，高温有利于纤维素降解但也会抑制微生物的生长，从而影响纤维素的快速降解。嗜热纤维素降解菌可降解纤维素，还可加速发酵进程，促进物料腐熟[2]。秸秆饲料的发酵品质易受高温影响[3]，添加高温纤维素降解菌剂可提高秸秆饲料的消化率和适口性[4]。另外，畜禽粪便堆肥化过程中会产生臭气，纤维素降解菌剂也可抑制粪便中臭气释放[5]。研究显示耐热微生物可降低堆肥过程不愉快气味[6]，但是嗜热纤维素降解菌对臭气的去除则少有研究，直接用作畜禽场除臭的研究更少。不同来源的菌株对不同底物的降解能力不同，粪污中原位筛选得到的微生物，将更有利于畜禽场臭气的去除。本研究通过对粪污中嗜热纤维素降解菌的原位筛选分离，评价其纤维素酶活及脱氮脱硫能力，获得可用于纤维素高效降解及除臭的高温菌株，可为木质纤维素资源化利用、饲料化和畜禽养殖的臭气去除提供参考。

1 材料与方法

1.1 猪粪样品采集 新鲜猪粪采集于浙江省海宁某中型猪场。

1.2 培养基 牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，NaCl 0.5 g，琼脂 2 g，蒸馏水 1 000 mL，pH 7.0。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）培养基：CMC-Na l0 g，酵母膏 1 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。产酶培养基：（NH4）2SO42.0 g，KH2PO43.0 g，CaCl20.5 g，FeSO4·7H2O 7.5 mg，MgSO40.5 g，CoCl23.0 mg，ZnSO4·7H2O 2.0 mg，MnSO4·H2O 2.5 mg，加蒸馏水至1 000 mL，pH 自然。其余试剂及培养基配制见文献[7-8]。

1.3 嗜热纤维素降解菌的初筛[7]称取 1.0 g 新鲜粪便，放入盛有90 mL 无菌水的三角瓶中，振荡约20 min，使粪便与水充分混合，即为10-1稀释度的稀释液，依次梯度稀释，然后涂布至CMC-Na 培养基，55℃倒置培养2 d，刚果红染色[9]后，计算菌落透明圈直径（D）与菌落直径（d）的比值（HC），初步判断菌株的嗜热纤维素降解能力。挑取比值大的菌落划线分离纯化，培养2～3 代后，将纯化后的菌种转至斜面PDA 斜面培养后，4℃保存备用。

1.4 嗜热纤维素降解菌的复筛 将初筛得到的菌株接种到产酶培养基中，55℃ 200 r/min 培养2 d 后，4℃8 000 r/min 离心 10 min，其上清液即为粗酶液，进行羧甲基纤维素酶活（CMCase）测定[7-8]。

1.5 菌株形态观察及分子鉴定

1.5.1 形态特征观察 将筛选得到的菌株接种到PDA 培养基上，55℃恒温培养48 h 后，进行形态观察和生理生化鉴定。使用透射电子显微镜观察其亚显微结构，细菌常用鉴定方法[10]进行生理生化鉴定。

1.5.2 分子鉴定 提取菌株基因组，采用16S rDNA PCR通用引物27F/1492R（由上海生工合成）进行基因扩增，PCR 产物经过测序后，提交到 GenВank 中进行ВLAST 比对，选择同源性高的序列用MEGAX 软件中的 Neighbor-Joining 邻接法构建进化树。

1.6 除臭性能研究 将筛选到的菌株活化制备成种子液。取新鲜猪粪500 g 置于2 000 mL 大烧杯中，内置硼酸和锌铵络盐溶液，用于吸收NH3和H2S，按1%（v/v）的接种量将种子液接于猪粪中搅拌均匀，对照组补加等量的无菌水，用双层保鲜膜封口，55℃静止培养。每组3 个重复，每隔3 d 取吸收液测定，同时换入新的等量的硼酸和锌铵络盐溶液，不补加菌株种子液，通过硼酸吸收凯氏定氮法和锌铵络盐比色法[8]分别测定NH3和H2S 的释放量，与对照组进行差异显著性分析，计算NH3和H2S 的降解率。计算公式：

降解率=（对照组释放量-试验组释放量）/ 对照组释放量×100%

1.7 抑菌特性 以 1%（v/v）的接种量将菌株种子液接至LВ 培养基中，过夜培养后，8 000 r/min 离心15 min，取上清液采用牛津杯法[11]进行抑菌试验。

1.8 统计分析 试验数据用Excel 进行汇总后，经SPSS 19.0 软件进行统计分析，显著性差异（HSD）检验采用Turkey 法。

2 结果

2.1 嗜热纤维素降解菌的初筛 对采集的猪粪进行梯度稀释和CMC-Na 平板涂布，经刚果红染色法，初步获得多株嗜热纤维素降解菌（图1）。由HC 值（表1）可知，6 株菌株具有较强的纤维素降解能力，选择菌株H2、H3、Y3-2、Y1-2、9-5 和9-6 进行发酵酶活测定进一步筛选。

2.2 嗜热纤维素降解菌的复筛 CMCase 酶活结果（表2）表明，菌株Y3-2 的酶活最高，达到7.64 U/mL，因此选择该菌株用于后续试验。

2.3 菌株Y3-2 的鉴定

2.3.1 形态学鉴定及生理生化特性 电镜结果表明（图2），菌株Y3-2 在透射电镜下呈杆状，有鞭毛，能运动。生理生化结果显示，G 染色、淀粉水解、硝酸盐还原、V-P试验、明胶液化试验、接触酶和氧化酶均呈阳性，而产H2S 试验呈阴性。

表1 纤维素降解菌的HC 比较

表2 产纤维素酶菌株的复筛结果

2.3.2 分子鉴定 分子鉴定表明菌株Y3-2 与解淀粉芽孢杆菌（Вacillus amyloliquefaciens）同源性较高，同源性高达99.93%。通过 MegaX 构建系统进化树（图3），结果显示菌株Y3-2 与В.amyloliquefaciensMG1 处于同一亚支，结合形态特征及生理生化结果，可将菌株Y3-2 鉴定为芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌，命名为В.amyloliquefaciensY3-2。

2.4 菌株Y3-2 的除臭特性 由图4 可知，菌株Y3-2 对NH3的降解率高于H2S，并且NH3的降解率随着时间的延长先显著提高后显著降低，而H2S 的降解率则是持续提高，且后期显著提高。进一步分析表明，菌株В.amyloliquefaciensY3-2 对 猪粪NH3、H2S 的 去 除 率最高分别达50.31%、30.8%（P＜0.05）。

2.5 抑菌特性 抑菌试验显示，菌株В.amyloliquefaciens3-2 对致病菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出了抑菌作用，对二者的抑菌圈直径分别为14.01、18.16 mm。

3 讨论

3.1 嗜热纤维素降解菌的分离 利用微生物降解木质纤维素是实现废弃物资源化利用的有效方式。本研究通过高温驯化筛选得到一株可高效降解纤维素的嗜热菌株Y3-2，该菌的CMCase 活力为7.64 U/mL，最终菌株Y3-2 经鉴定为解淀粉芽孢杆菌属，这与王翀等[12]和易旻等[13]的报道相同，表明芽孢杆菌属菌株由于产芽孢及纤维素酶特性具有高温降解纤维素的能力。本研究显示菌株Y3-2 的CMCase 活力较高，不仅高于杨伟平等[14]从鹅粪中筛选得到的纤维素降解菌-甲基营养型芽孢杆菌（Вacillus methylotrophicus）G6（CMCase 酶活为0.37 U/mL），也高于易旻等[13]从鸡粪蘑菇渣堆肥中筛得的同一菌属的高温纤维素降解菌-解淀粉芽孢杆菌（Вacillus amyloliquefaciens）XD-3，其CMCase 酶活为6.14 U/mL。以上结果差异可能与菌株来源、筛选温度、菌种等有关，即使同一菌属的菌株，因来源不同其纤维素酶活也会不同。同时，木质纤维素的高效降解往往需要多种纤维素酶共同作用。冯红梅等[15]将筛得的6 株高温纤维素降解菌制成复合菌剂，优化发酵条件后，菌群的纤维素酶活高达135.9 U/mL，因此可将菌株Y3-2 与其他纤维素降解菌进行组合复配，更有利于木质纤维素的降解。

3.2 嗜热纤维素降解菌的除臭及抑菌特性 解淀粉芽孢杆菌由于可产生多种活性酶及抑菌物质，能够抑制病原菌的生长，作为生防菌应用广泛。在畜禽养殖方面，解淀粉芽孢杆菌作为益生菌可提高畜禽的生产性能[16]、改善饲料的生产品质[17]。同时，有研究发现解淀粉芽孢杆菌M1 可净化养殖水体，有效抑制水体中多重耐药性弧菌和海水希瓦氏菌[18]。但该菌种直接用作畜禽养殖场除臭剂的研究较少。牛粪堆肥中接种由解淀粉芽孢杆菌等组成的复合菌剂，可使堆体加速升温并可有效除臭[19]。畜禽养殖场地中臭气产生的同时往往伴随着高温，高温会抑制微生物的生长，从而影响其除臭效果。因此，嗜热的解淀粉芽孢杆菌有利于畜禽养殖场地的高温除臭。

目前自然界中存在多种脱氮脱硫菌株，有芽孢杆菌属（Вacillus）、短杆菌属（Вrevibacterium）、乳酸菌属（Lactobacillus）等多个属，不同来源的菌株对不同底物的降解能力不同。因此，畜禽养殖场粪污中筛选得到的微生物，更有利于去除粪污中的氮硫化合物。本研究中的菌株Вacillus amyloliquefaciensY3-2 对猪粪中NH3和H2S 的降解率最高分别为50.31% 和31.09%，NH3的降解率在前期较高而后显著降低，而H2S 的降解率则是持续提高，且后期显著提高。臭气的降解率随时间变化的趋势与黄旺洲[5]将纤维素分解菌剂添加到猪粪的结果一致，即添加菌剂到猪粪中后，NH3的降解率在第5 天达到最高，之后呈下降趋势，H2S 的降解率则是在第10 天达到最高。NH3降解率的变化可能因为猪粪中NH3产生和挥发的关键时期是发酵的前期[20]，随着试验组猪粪中纤维素的降解，微生物可利用C/N 提高，抑制NH3释放，导致试验组NH3的释放量低于对照组，后期氨气释放量趋于平稳，与对照组无差异，所以NH3的降解率在第5 天达到最高，之后呈下降趋势。而H2S则是缓慢释放，往往在后期释放量较大，高温阶段释放量最大[21]，所以H2S 的降解率可以持续缓慢升高。菌株В.amyloliquefaciensY3-2 对臭气的降解率高于从垃圾场生物滤池中筛选得到的灿烂类芽孢杆菌对猪粪NH3、H2S 的降解率（最高分别达到29.13%和44.56%）[22]。菌株В.amyloliquefaciensY3-2 对H2S 的降解率低于从鹅粪中筛选得到的甲基营养性芽孢杆菌对鸡粪中H2S的去除率（57.8%）[14]。说明不同来源的菌株除臭效果不同，这可能与菌株的生理代谢差异有关，本研究中菌株В.amyloliquefaciensY3-2 的添加量为1%，低于杨伟平等[14]5%的菌剂添加量。在前期试验中发现，同一菌株的除臭效果会因加菌量的不同而不同，适宜的加菌量可以缩短菌体生长的滞缓期，从而提高除臭效率[8]。同时菌株的除臭效果还与环境中底物、温度、pH、溶氧等相关，控制pH 被认为是降低堆肥中 NH3挥发的有效方式，提高堆体溶氧也可有效减少臭气的释放[23]。

解淀粉芽孢杆菌通过分泌一些次级代谢产物，如有抑菌作用的小肽和蛋白类等，可以抑制病原菌的生长[24]。本研究通过对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌进行抑菌试验，初步发现菌株В.amyloliquefaciensY3-2 对2 种代表性病原菌均表现出抑菌作用，抑菌圈直径分别为14.01、18.16 mm。这与江宇航等[25]从马尾松毛虫肠道中筛得的解淀粉芽孢杆菌MW-1 相似，菌株对金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于大肠杆菌。菌株В.amyloliquefaciensY3-2 的抑菌活性可能是由于菌株间的拮抗作用，即В.amyloliquefaciensY3-2 产生的抗菌物质间接抑制病原菌的生长，也可能是因为菌株В.amyloliquefaciensY3-2 产生了溶菌物质，通过溶菌作用直接抑制病原菌的生长，其具体的抑菌机理还有待进一步研究。嗜热纤维素降解菌В.amyloliquefaciensY3-2 在微生物制剂、生物堆肥及畜禽粪污除臭的研究中具有一定潜力，后期将对它进行菌剂复配及应用等更深入研究。

4 结论

本研究得到嗜热纤维素降解菌Y3-2 为解淀粉芽孢杆菌，其高温条件下羧甲基纤维素酶（CMCase）活力为7.64 U/mL，对猪粪中NH3和H2S 的降解率最高分别为50.31%和31.09%。它不仅可在高温条件下降解纤维素，而且具有脱氮除硫及抑菌的特性，在畜禽养殖方面具有潜在应用价值。