高温环境对通城猪血清生化指标及空肠组织HSP70与HSP90mRNA 表达的影响

高登营 ，连维思，康亭亭，李文超，邢文凯，赵展展，黄 程，雷明刚,2*，李 胜

（1.华中农业大学动物遗传育种与繁殖国家重点实验室，湖北武汉 430000；2.华中农业大学国家家畜工程技术研究中心，湖北武汉 430000；3.通城县国营种畜场，湖北咸宁 437400）

随着畜禽养殖业向着集约化、规模化转型，形成了饲养密度高、控温难的养殖环境，高温环境应激对动物的影响最广泛也最难以避免。猪无汗腺，对高温异常敏感，极易发生热应激。当猪只的产热总量超过其散热能力时，便会发生热应激，体温升高，采食量下降，生理机能紊乱，组织器官损伤[1]。热应激状态下，机体会自主调节增加体表和组织器官的血流量，促进热量散失，从而维持体温稳定[2]，但长时间持续高温会使皮温和直肠温度升高。由于血液是动物机体内各种因子运输的载体，也是实现体液调节的途径，所以检测猪只的血液生化指标可以直观反映出猪只生理机能的变化[3]。发生热应激时，流经肠道的血流量显著下降，肠道组织会因缺血、缺氧而产生损伤[4]，使组织细胞膜通透性提高，加快胞内活性酶逸出流入血液[5]。热应激蛋白（Heat Shock Proteins，HSPs）是保护机体免受应激损伤的一类多肽类蛋白质，HSP70 和HSP90 是HSPs 家族中最重要的蛋白[6]。热应激发生后小肠组织中HSP70、HSP90mRNA 表达量显著升高，表明热应激可以促进组织中HSP70和HSP90的表达[7]。

通城猪是长江流域地方猪种，繁殖力强，易受孕，母性好，在-15℃和40℃的环境下均表现出极强的适应性[8]，是我国优秀的地方品种。在夏季，通城猪长期处于高温高湿环境，研究热应激对通城猪的影响以及其耐热性机制具有重要的经济价值和现实意义。目前，有关热应激对通城猪的影响的研究鲜有报道。因此本试验旨在研究热应激对通城猪体温、呼吸频率、血清生化指标和空肠组织HSP70、HSP90 的影响，为研究通城猪的耐热机制提供参考，也为通城猪的健康养殖实践提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理 选取30 头100 日龄、体重（45±5）kg、血统相近的雌性通城猪，随机分为6 组，分为对照组和热应激组（热应激2、4、6、8、10 d），每组5 头。将试验猪（28±1）℃下适应性饲养7 d，全部自由采食，自由饮水，于第8 天开始，对照组仍置于（28±1）℃条件下，处理组迅速升温至（39±1）℃并分别热应激处理2、4、6、8、10 d（每天09：00—16：00）。

1.2 体表皮温度、直肠温度和呼吸频率的测定 于试验开始，利用红外线测温枪（MT-4606），购自台湾宝工工具旗舰店；兽用肛温计购自中农康蓄牧业专营店，分别在热应激2、4、6、8、10 d，在每天10：00—16：00每个整点对每组（5 头）热应激猪只进行额头、耳、鼻、背、臀和直肠温度的测定，以猪腹部的每分钟起伏次数，记录呼吸频率，并对猪舍内外温度进行记录。

1.3 血清生化指标的测定 在对照组和各热应激组到达相应时间点，对每组猪进行空腹前腔静脉采血10 mL，3 000 r/min 离心10 min，分离血清，-80℃冰箱保存，利用血清生化测定仪器（贝克曼库尔特AU5811）和美国贝克曼库尔特公司的原装试剂测定各组血清总蛋白（Total Protein，TP）、白蛋白（Albumin，ALВ）、球蛋白（Globulin，GLВ）、谷草转氨酶（Aspartate Transaminase，AST）、碱性磷酸酶（Alkaline Phosphate，ALP）、乳酸脱氢酶（Lactic Dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（Creatine Kinase，CK）。

1.4 空肠组织HSP70、HSP90 mRNA 表达测定

1.4.1 组织样RNA 提取 试验结束后实验猪屠宰取空肠组织，用PВS 溶液反复冲洗，至残留血液和内容物完全去除，立刻放入液氮，冷冻后进行组织研磨，Trizol法提取总RNA，使用微量分光光度计检测RNA 浓度后-80℃保存。

1.4.2 cDNA 合成 利用Prime Kit with gDNA Eraser 试剂盒（TaKaRa 公司）进行反转录合成cDNA，-20℃保存。

1.4.3 引 物 设 计 与 合 成 根 据GenВank 中HSP70、HSP90和β-actin基因序列，利用Primer Premier5.0 软件设计3 对引物，并由武汉擎科生物公司合成，引物序列见表1。

1.4.4 实时荧光定量RCR 检测 以cDNA 为模板，采用Light Cycler®480ΙΙ/96（Roche）实时定量PCR 系统 检测基因表达情况。荧光定量反应体系为20 μL：SYВR Mix10 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 补至20 μL。扩增程序为95℃预变性10min，95℃变性15s，60℃退火20 s，共40 个循环。基因相对表达量采用2△△Ct法计算，以β-actin 作为内参基因。每组试验重复3 次。

表1 基因引物信息

1.5 统计分析 数据经Excel 处理后，采用ΙВM Spss Statistics 21 进行单因子方差分析，试验数据均以平均值± 标准误差（SEM）表示。以P＜0.05 作为差异显著性标准。

2 结果与分析

2.1 热应激对通城猪皮温、直肠温度和呼吸频率的影响如图1 所示，随着环境温度的升高，猪只各部位表皮温度变化不大；热应激使猪只直肠温度升高，并超出最高正常值；热应激使猪只呼吸频率显著增加，随着热应激时间增长呼吸频率变快且不稳定。

2.2 热应激对通城猪血清生化指标的影响 如表2 所示，与对照组相比，热应激2、4 d 组血清TP、ALВ 和GLO显著降低，且4 d 组达最低值；AST 在热应激第4、10 天含量降低，热应激第8 天升高，呈现波动性变化（P＜0.05）；碱性磷酸酶含量在热应激2、4、6、8 d显著升高，且4 d 时达到峰值；与对照组相比，LDH 含量在2、4、6 d 显著升高，且4 d 时达峰值；血清CK含量在所有热应激组显著升高，且在4 d 时达峰值。

2.3 热应激对通城猪空肠组织HSP70、HSP90mRNA 表达的影响 如图2 所示，与对照组相比，热应激处理第4 天，空肠组织HSP70、HSP900 mRNA 表达水平显著升高。与对照组相比其他热应激组HSP70、HSP90mRNA 表达水平略有升高但差异不显著。

3 讨论

当猪遭受热应激时，会对环境温度的升高做出适应性反应，如通过增加呼吸频率蒸发体内更多热量、增加饮水降低体内热量、减少采食量减少产热等[9-10]。正是因为这种适应性反应，随着环境温度升高，猪的皮肤温度会随之升高，呼吸频率加快。Yan[11]报道，猪在热应激条件下直肠温度、呼吸率显著高于适温水平，其中直肠温度相差0.3～0.8℃，平均皮温相差4～5℃。Patience 等[12]研究高温下猪的代谢试验，发现38℃高温下热应激10 d 后，与20℃常温相比，高温组呼吸速率达105.2 次/min，对照组为15 次/min，直肠温度从38.4℃升高到39.7℃。本试验发现热应激使妊娠早期通城猪直肠温度升高，呼吸速率大大增加且不稳定，但是皮温变化不明显，提示通城猪在热应激条件下对自身皮温的调节能力较强，猜测与通城猪是夏季高温高湿地区的地方猪种有关系。

血清生化指标常用来反映动物体内物质代谢和组织器官机能变化，并广泛应用于研究热应激对机体的影响。热应激可以抑制动物机体的免疫机制，促进皮质醇的分泌，进而增强蛋白分解代谢，降低血清TP、ALВ、GLВ 含量[13-14]。Mahesh 等[15]研究发现山羊在短期热应激后血清TP、ALВ、GLВ 含量出现不同程度的降低，而延长热应激时间则会增加血清TP、ALВ、GLВ 含量。本研究发现通城猪在热应激2、4 d 期间血清TP、ALВ、GLВ 含量显著降低，而在第6～10 天呈现上升趋势恢复至对照组水平。说明通城猪在2～4 d 短期热应激期间体内皮质醇分泌增多，使血清蛋白的分解能力加强，血清蛋白含量显著降低；在6～10 d 长期热应激期间，皮质醇含量降低使血清蛋白含量恢复正常水平。猜测因为通城猪对持续性高温抗逆性强，适应能力好，具体的抗逆性机制需进一步研究。机体正常情况下，酶存在于细胞内，作为代谢所需的催化剂，应激会使细胞膜通透性增加或者破损，加快酶进入血液，使血液中酶含量升高，进而造成代谢紊乱[16]，因此血清中酶的活性可以反映热应激程度。Sevi[17]和Helal 等[18]研究表明热应激使动物血清中ALP 活性下降，也对LDH 的活性产生影响，从而影响机体代谢。Sharma 等[19]研究发现山羊在热应激时血清AST 水平没有显著变化。李俊杰等[20]研究表明热应激使牛血清CK 活性增加。本研究发现通城猪在热应激期间，除AST 呈波动性变化外，血清ALP、LDH、CK 含量均显著升高，且在热应激4 d 达到峰值，表明热应激对通城猪组织器官造成损伤，使酶加快进入血液。热应激4 d 后，随热应激时间增长，酶含量逐渐恢复至对照组水平，说明在长期热环境下的通城猪对热应激的调节能力较好。

表2 热应激对通城猪血清生化指标的影响

通城猪空肠组织HSP70、HSP90mRNA 表达水平都在热应激第4 天达到峰值，其作为HSP 家族中最具代表性的具有分子伴侣和抗细胞凋亡作用的成员，可以对热应激产生一定的耐受作用，但这种耐受能力被限制在一定范围内[21]。本研究结果表明，热应激第4 天空肠组织HSP70、HSP90mRNA 表达水平显著升高，随后表达量降低，表明通城猪在热应激第4 天左右会通过提高HSP70、HSP90的表达来应对机体的应激状况，但在4 d 之后表达量随之下降，所以得出通城猪对热应激的最大耐受天数在4 d 左右。

4 结论

本试验结果显示，热应激使通城猪的直肠温度升高，皮温无显著变化，呼吸频率增强；热应激显著降低TP、ALВ 和GLO 浓度，并在第4 天达最低值，血清ALP、LDH 和CK 随热应激处理时间增加显著升高，并在第4 天达峰值；空肠组织HSP70、HSP90mRNA 表达水平在热应激第4 天显著升高，随后降低。通城猪作为优秀的地方猪品种，在高温环境下，可通过调节皮温、血清蛋白和HSP70、HSP90 的变化来应对应激，并推测热应激第4 天是应激反应的重要节点，具体的调控机制值得深入研究。