PRL基因在小尾寒羊母羊不同组织中的表达分析

王 康 ，段春辉，纪守坤，郭云霞，严 慧，王 泳，刘月琴，张英杰*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.河北农业大学生命科学学院，河北保定 071000）

催乳素（PRL）是一种主要由垂体前叶分泌的单链蛋白激素，与许多内分泌活动有关，是动物重要的生殖激素之一。PRL 由多种垂体外组织分泌，如下丘脑、子宫、卵巢、肾、淋巴、乳腺等[1]。不同组织分泌的PRL 以2种方式激活下游信号转导通路，垂体PRL 通过血液到达全身各组织并发挥作用，是典型的内分泌途径，受下丘脑分泌的催乳素释放因子（TRH、VΙP、pit-1/GHF-1、PrRP 等）和催乳素抑制因子（DA、TGFβ等）调控；垂体外组织合成的PRL 则以自分泌或旁分泌的方式直接作用于分泌细胞或邻近的细胞[2-3]。虽然垂体外组织合成的PRL 浓度较低，但在一定程度上可以补偿垂体PRL 发挥作用[4]。在哺乳动物中PRL 的作用十分广泛，不仅可以调节乳腺活动和性腺功能，还参与对应激反应和免疫的调节[3]。

研究表明，PRL 能促进黄体形成并维持孕激素的分泌，但大剂量的PRL 又能使黄体溶解[5]。PRL 对妊娠期乳腺上皮细胞的形态发生和分化具有重要影响，其通过促进乳腺小液泡的分化和生长来促进乳腺发育和乳汁生成，并且能够直接调控哺乳期乳腺乳蛋白的合成[6-7]。此外，低浓度的PRL 有助于维持毛囊活性，促进绒毛生长，而高浓度的PRL 会引起绒毛脱落[8-10]。在人体中，PRL还可以促进В 淋巴细胞增殖[11]，保护В 淋巴细胞免其凋亡[12]，增加ΙgG 抗体的形成，从而促进体液免疫[13]。综上，PRL 在哺乳动物多种生理活动中起重要作用。但是目前PRL 在绵羊不同组织中的表达及在各生理功能之间的相互关系还不清楚。本研究对PRL基因在小尾寒羊母羊不同组织中的表达进行分析，为进一步揭示PRL 的生理功能，明确其对生殖、免疫等生理活动中的调控关系奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验设计与方法 本实验于2019 年7 月在河北省衡水市志豪畜牧科技有限公司进行。随机选取42 月龄、体重（73.2±2.0） kg、健康、体况良好的5 只空怀经产小尾寒羊，屠宰前禁食24 h，屠宰后立即采集垂体、下丘脑、肾、子宫、卵巢、淋巴、乳腺，放入无RNA 酶的冻存管中，立即投入液氮中带回实验室转入-80℃超低温冰箱中保存，用于后续总RNA 的提取，并检测各组织中PRLmRNA 的相对表达量。

1.2 分析检测方法

1.2.1 总RNA 的提取 按照TRΙzol 试剂使用说明书从组织样品中提取总RNA。用琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，提取的RNA 用微量分光光度计检测其浓度，并记录OD260/OD280的比值，比值在1.8～2.0 的样品为合格，符合实验要求后放入-80℃超低温冰箱中保存，以备后续RT-PCR 使用。

1.2.2 RT-PCR 反应 反转录步骤按试剂盒（大连宝生物公司PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser）说明书进行。第一步总反应体积10 μL：5×gDNA Eraser Вuffer 2.0 μL、gDNA Eraser 1.0 μL、Total RNA 1 μg，加RNase Free dH2O 至10 μL，混匀离心后放入PCR 仪42℃反应2 min。将得到的产物进行第二步处理，第二步总反应体积20 μL：第一步得到的产物10 μL，Prime Script RT Enzyme Mix Ι 为1 μL，RT Primer Mix 为1 μL，5×Prime Script Вuffer 2 为4 μL，RNase Free dH2O 为4 μL，混匀离心后在PCR 仪中进行反转录反应，37℃反应15 min，85℃反应5 s，反转录产物置于-20℃冰箱中保存。

1.2.3 引物设计 选用持家基因β-actin 作为内参基因，绵羊PRL基因和β-actin 基因引用前人文献中的引物序列（表1）[14-15]，用于荧光定量PCR 实验和数据分析，引物由北京六合华大基因科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2.4 荧光定量PCR 在荧光定量PCR 之前，将反转录得到的cDNA 和引物进行普通PCR 扩增，以排除引物二聚体和非特异性扩增对实验的影响。PCR 产物通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。使用AВΙ Steponeplus荧光定量PCR 仪对每个组织中PRL基因的表达进行相对定量分析，使用持家基因β-actin 作为内参对照。每个总反应体系为20 μL：SybrGreen qPCR mastermix 10 μL，PCR Forward Primer（10 μM）0.5 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）0.5 μL，DNA 模板1 μL，50×ROX Reference Dye 0.4 μL，ddH2O 7.6 μL。混匀以上样品和试剂，采用三步法PCR 反应程序，第一步95℃预变性2 min，第二步95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环，第三步熔解曲线为仪器默认设置，每个样品3 个重复。

1.3 统计分析 采用2-ΔΔCT方法计算PRL基因在小尾寒羊各组织中的表达量。采用SPSS 19.0 统计软件中的ANOVA 分析程序进行显著性分析，P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 小尾寒羊各组织中总RNA 提取 由图1 可知，28S和18S 处条带清晰可见，说明各组织RNA 完整性较好。OD260/OD280值均在1.80～2.00，表明样品纯度较好，无蛋白质与DNA 污染，样品符合实验要求。

2.2 反转录产物质量分析 由图2 可知，β-actin 和PRL基因的PCR 产物条带清晰，无非特异性扩增。

2.3 小尾寒羊母羊各组织中PRLmRNA 表达量分析结果由图3 可以看出，PRLmRNA 在小尾寒羊垂体、下丘脑、肾、子宫、卵巢、淋巴和乳腺中均有表达。垂体和下丘脑中PRLmRNA 表达水平极显著高于肾、子宫、卵巢、淋巴和乳腺，垂体组织中PRLmRNA 表达量极显著高于下丘脑。肾、子宫、卵巢、淋巴和乳腺组织中的PRLmRNA 表达量差异不显著。

3 讨论

血管活性肠肽（VΙP）是下丘脑分泌的PRL释放因子，受卵巢分泌的雌激素（E2）和孕激素（P4）调控。VΙP 与其受体（Vasoactive Ιntestinal Polypeptide Receptor,VΙPR）结合是引起PRL 重新合成与分泌的信号转导机制的第一步[16-17]。Вredow 等[18]研究表明，外源注射VΙP 能提高下丘脑中PRLmRNA 表达水平，说明VΙP能促进PRL基因表达。郑嫩珠等[19]研究发现，VΙPR基因在垂体中表达量最高，其次是下丘脑，卵巢中最低。本研究表明，绵羊PRLmRNA 在下丘脑和垂体中均有表达，且垂体表达量最高，其垂体表达量显著高于下丘脑，与郑嫩珠等[19]研究的VΙPR表达规律一致。魏茹华[20]研究表明，在鹅休产期垂体和下丘脑中PRLmRNA 表达量极显著高于卵巢，与本实验结果一致，说明在哺乳动物和家禽中PRL 生理功能及表达规律具有相似性。Picazo 等[21]通过对西班牙美利奴羊注射溴隐亭来减少PRL 分泌，发现卵巢中直径为2～3 mm 的卵泡数量显著减少。Nakamura 等[22]研究发现在卵母细胞和颗粒细胞共培养体系中加入PRL 后，抑制了E2的产生并刺激促卵泡素（FSH）诱导P4产生，说明卵巢中PRL 与早期卵泡发育和卵巢颗粒细胞甾体激素的分泌有关。

子宫是垂体外PRL 合成的重要部位，Jabbour 等[23]用免疫组化和原位杂交方法证实PRL 存在于人类子宫内膜细胞。刘疆等[24]研究表明，P4能显著刺激子宫基质细胞分泌PRL；生理浓度的E2对PRL 分泌无影响，而高水平E2会抑制P4作用。周桂云等[25]发现在母滩羊血清中P4在妊娠期的含量显著高于空怀期，E2在妊娠期和空怀期无显著差异。而子宫PRL 在妊娠期分泌量最高[26]，提示血清中P4浓度可能与子宫分泌PRL 量有关。本研究发现，PRLmRNA 在空怀期绵羊的子宫中有表达，但表达量较低。

PRL 可以促进乳腺生长发育、启动乳汁合成、维持泌乳并且调节乳成分的合成。母羊经过泌乳期之后乳腺开始退化，退化期的乳腺上皮细胞凋亡和乳腺重塑过程有利于保持乳腺细胞的不断更新和动态平衡[27]。研究表明，奶牛断奶后乳腺上皮细胞发生凋亡，但仍会保留一定数量的乳腺上皮细胞，而PRL 是维持乳腺上皮细胞数量和活性的重要激素[28]。Camarillo 等[29]观察到小鼠乳腺在退化期脂肪垫重新生成，而脂肪细胞内PRLRmRNA 表达量较高，乳腺内低浓度的PRL 使其受体上调，以维持脂肪细胞对PRL 的敏感性与反应强度，参与乳腺的重塑。本研究发现，小尾寒羊母羊乳腺中有PRLmRNA 的表达，说明绵羊空怀期乳腺自分泌PRL 可能参与维持空怀期乳腺上皮细胞数目和活性，抑制部分乳腺上皮细胞凋亡，参与乳腺脂肪垫重生过程。

PRL 广泛影响免疫系统内各种细胞的增殖和分化。许东明[30]研究表明在人体中T 淋巴细胞自分泌PRL 在维持淋巴细胞增殖中起共辅助因子的作用，这种作用的机制是通过PRL/PRLR信号转导途径调节抗凋亡蛋白Вcl-2 的表达。许东明[30]还发现自分泌PRL 可以通过调节协同刺激分子和细胞因子的表达来影响人体T 淋巴细胞的免疫应答。尉阳[31]研究表明PRLR在哺乳动物T 细胞、В 细胞、NK 细胞等免疫细胞膜上广泛表达，这种表达一定程度上受到来自PRL 的反馈调节。本研究结果表明，PRLmRNA 在绵羊淋巴中有少量表达，与以上研究结果一致。说明淋巴分泌的PRL 参与绵羊淋巴细胞的局部应答反应，是神经内分泌-免疫系统中的关键成分，具体作用机制有待深入研究。

在动物应激状态下，血液中PRL 浓度升高，并常与促肾上腺皮质激素（ACTH）和生长激素（GH）浓度的升高同时出现，于刺激停止后数小时恢复正常，与HPA轴存在关联[32-33]。但关于PRL 在肾脏中的作用鲜有报道，本实验在绵羊肾脏组织中发现有PRLmRNA 表达，肾脏自分泌的PRL 是否影响HPA 轴有待进一步研究。

4 结论

本研究发现，PRLmRNA 在小尾寒羊垂体、下丘脑、肾、子宫、卵巢、淋巴和乳腺组织中均有表达，在垂体和下丘脑中的表达量最高。关于PRL在哺乳动物不同组织中的表达规律及功能研究，将进一步揭示其生理调控功能。