大黄提取物对缺血性脑损伤大鼠细胞凋亡的抑制作用

唐宇恒，刘俊杰，黄 鑫，孙春晓，许阿娟，杨泽霖，赖文芳，洪桂祝

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

脑卒中，又称脑中风，是一种由脑部血液循环障碍引起脑组织损伤及局灶性神经功能缺失的急性脑血管疾病。缺血性脑卒中是脑卒中的主要发病类型，约占脑卒中的87%[1]。缺血性脑卒中通常导致血管闭塞、脑缺血缺氧、脑组织坏死，最终导致神经功能障碍[2]。研究表明，缺血性脑卒中所引起的出血转化使脑卒中的严重程度明显增加[3]。组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator，tPA)溶栓治疗作为目前缺血性脑卒中患者的治疗标准，因其治疗窗窄(4.5 h)、溶栓可能导致脑内出血，使出血性转换的风险增加等限制了tPA的临床应用[4]。因此，目前迫切需要研发更为有效、安全地治疗脑卒中的药物。

大黄作为一种常见的传统中药，据《洁古家珍》中记载治疗急性脑卒中所用之三化汤便是以大黄为主要成分。大黄的主要化学成分为蒽醌类、二苯乙烯类、花青素类、黄酮类、有机酸类和色素类等[5]。研究表明，大黄在脑卒中临床上多有应用研究[6]，在脑中风后发挥抗炎和脑保护作用[7-8]。课题组前期研究发现大黄素可抑制脂多糖诱导的星形胶质细胞炎症反应[9]；大黄苷元可通过改善脑缺血/再灌注大鼠中的脑梗死和神经元凋亡而发挥保护作用，从而能改善其神经功能[10]。因此，本文主要研究大黄提取物对缺血性脑损伤大鼠脑组织细胞凋亡的抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物45只SPF级健康♂SD大鼠，体质量(260～280) g，购于上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：2015000510392，许可证号：SCXK(沪)2012-0002。饲养在福建中医药大学实验动物中心，许可证号：SYXK(闽)2014-0005。

1.2 药物与试剂

1.2.1药物 大黄经福建中医药大学中药鉴定学教研室鉴定为蓼科(Polygonaceae)大黄属(RheumL.)植物的干燥根茎，药材经鉴定游离蒽醌含量约为大黄的0.5%，符合2015版药典标准(不得少于0.20%)。

1.2.2试剂 TUNEL试剂盒(Promega，货号G3250)；胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗体(货号ab7260)、TRITC标记羊抗兔IgG(货号ab6718)，均购于Abcam公司；RNeasy®Mini Kit(Qiagen公司，货号74134)；PCR引物由生工生物工程上海有限公司设计合成，IL-1β引物上游序列5′-CTGTCTGACCCATGTGAGCTG-3′，下游序列5′-TTTGTCGTTGCTTGTCTCTCCTT-3′；iNOS引物上游序列5′-CAAGCACCTTGGAAGAGGAG-3′，下游序列5′-AAGGCCAAACACAGCATACC-3′；Bax抗体(货号2772)、Bcl-2抗体(货号15071)、caspase-3抗体(货号9662)、cleaved caspase-3抗体(货号9661)，均购于Cell Signaling Technology公司；β-actin抗体(碧云天生物技术有限公司，货号AA128)。

1.3 仪器生物组织石蜡包埋机、石蜡切片机(湖北孝感亚光医用电子有限公司)；激光共聚焦显微镜(德国Zeiss公司)；倒置荧光显微镜(德国Leica公司)；Microfuge®22R台式微量离心机(美国Beckman Coulter公司)；ND2000C紫外可见分光光度计(美国Thermo公司)；Centrifuge 5804(R)台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)；7900H-PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；Chemi-Doc XRS+凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。

1.4 大黄提取称取干燥大黄根茎200 g，粉碎后置于500 mL圆底烧瓶中，加乙醇250 mL加热回流2 h；纱布过滤提取2次，将2次滤液合并，减压浓缩过滤，将滤液转入蒸发皿，蒸发至无醇味，浓缩液干燥后得大黄提取物20 g固体粉末(1 g相当于10 g生药量)；加含0.1%羧甲基纤维素钠(Sodium carboxymethyl cellulose，CMC-Na)的生理盐水溶解，配制成30 g·L-1的混悬溶液，置于4 ℃冰箱备用。

1.5 动物实验分组及给药45只♂SD大鼠随机分为假手术组(sham)、模型组(MCAO)和大黄提取物组(MCAO+rhubarb extract)，每组各15只。MCAO造模2 h后，进行灌胃。给药组灌胃给予大黄提取物200 mg·kg-1·d-1(参考60 kg成人临床水煎液常用剂量0.33 g·kg-1·d-1，乘以醇提物约10%的提取率后折算成大鼠等效剂量)，其余组灌胃等体积的含0.1% CMC-Na的生理盐水，连续6 d给药。

1.6 动物实验MCAO造模用2%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)对大鼠腹腔注射麻醉后，剪开颈部皮肤，用止血钳钝性分离皮下组织，暴露并分离左侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，用缝合线结扎颈总和颈外动脉，用动脉夹夹闭颈内动脉远心端，在颈总距离颈内、颈外动脉分叉部1 cm处剪一小口，将尼龙线栓由颈总动脉推进至线栓标记黑点进入颈内动脉后离三叉处0.5 mm，结扎颈内动脉近心端以固定线栓。2 h栓塞后，拔出线栓，实现再灌注。假手术组除不进行插线栓操作外，其余操作相同。参考Zea Longa评分法，每天对动物进行神经功能评分，评分≥2分的视为实验模型制备成功，可用于后续实验。

1.7 TUNEL染色将制备好的脑组织切片65 ℃烘40 min后脱蜡复水，滴加新配的蛋白酶K工作液(20 mg·L-1)，室温孵育10 min，PBS洗3次，每次5 min；按照试剂盒要求配制好TUNEL检测液，在组织片上滴加适量检测液，37 ℃孵育60 min，PBS洗3次，每次5 min；滴加DAPI染液室温避光孵育8 min，PBS洗3次，每次3 min，加抗淬灭剂，激光共聚焦显微镜下观察，用ImageJ软件计算各组TUNEL阳性细胞表达率。

1.8 免疫荧光染色检测GFAP的表达大鼠给药6 d后取脑组织，用4%多聚甲醛固定24 h；脑模具将脑组织均分为6片，之后过缸脱水、石蜡包埋及切片。脑组织切片烘干后进行脱蜡复水、热抗原修复，冷却后用PBS缓冲溶液清洗3次，每次5 min；滴加5%BSA室温封闭2 h，加入一抗(GFAP抗体，1 ∶500稀释)，4 ℃孵育过夜；次日用PBS洗3次，每次10 min，加荧光二抗(1 ∶500)室温避光孵育1.5 h，PBS清洗3次，每次5 min；滴加DAPI染液室温避光孵育8 min，PBS洗3次，每次3 min；加荧光抗淬灭剂，荧光显微镜下观察。

1.9 RT-qPCR检测IL-1β、iNOS mRNA表达按照RNeasy®Mini Kit试剂盒的描述，提取脑组织总RNA，检测RNA浓度及纯度，以A260/A280值达到1.8～2.2表示纯度合格；调整各组浓度至同一水平，按逆转录试剂盒说明，RNA逆转录成cDNA，以cDNA为模板，通过实时荧光定量PCR仪检测IL-1β、iNOS mRNA表达。以GAPDH为内参计算2-ΔΔCt值。

1.10 Western blot检测GFAP、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和caspase-3蛋白表达提取总蛋白，采用SDS-PAGE电泳，经两步法将总蛋白分离后，将凝胶中的蛋白转移至PVDF膜，5% BSA封闭2 h，加入稀释后的一抗(GFAP抗体1 ∶10 000，Bax抗体1 ∶1 000，Bcl-2抗体1 ∶1 000，caspase-3抗体1 ∶1 000，cleaved caspase-3抗体1 ∶1 000，β-actin抗体1 ∶3 000)；放4 ℃冰箱里孵育过夜；次日，TBST清洗3次，每次10 min，加入HRP标记的二抗(1 ∶1 000稀释)，室温下孵育2 h，TBST清洗3次，每次10 min，加ECL显色剂经凝胶成像分析系统检测，分析各目标条带的灰度值，分别计算各组与β-actin灰度值的比值，并统计各组之间的差异。

2 结果

2.1 大黄提取物对MCAO大鼠TUNEL阳性细胞表达的影响与Sham组相比，经TUNEL染色，结果表明，MCAO模型组中大鼠TUNEL阳性细胞表达升高，经大黄提取物干预后，大鼠TUNEL阳性细胞表达降低，且差异具有显著性(P<0.05)，见Fig 1。

Fig 1 TUNEL in MCAO rats reduced by ##P<0.01 vs sham; **P<0.01 vs MCAO

2.2 大黄提取物对MCAO大鼠GFAP表达的影响与Sham组相比，经免疫荧光染色和Western blot检测，结果表明，MCAO模型组中大鼠GFAP表达升高，经大黄提取物干预后，GFAP表达降低，且差异具有显著性(P<0.05)，见Fig 2。

Fig 2 GFAP in MCAO rats reduced by ##P<0.01 vs sham; *P<0.05, **P<0.01 vs MCAO

2.3 大黄提取物对MCAO大鼠IL-1β、iNOS mRNA表达的影响与Sham组相比，经RT-qPCR检测，结果表明，MCAO模型组中IL-1β、iNOS mRNA表达升高，经大黄提取物干预后，IL-1β、iNOS mRNA表达降低，且差异具有显著性(P<0.05)，见Fig 3。

Fig 3 Effects of rhubarb extract treatment on IL-1β(A), iNOS(B) mRNA in MCAO rats n=3)#P<0.05 vs sham; *P<0.05 vs MCAO

2.4 大黄提取物对MCAO大鼠Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3和caspase-3蛋白表达的影响与Sham组相比，经Western blot检测，结果表明，MCAO模型组中Bax、cleaved caspase-3蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，经大黄提取物干预后，GFAP、Bax、cleaved caspase-3蛋白表达降低，但总的caspase-3蛋白表达无影响，Bcl-2蛋白表达升高，且差异具有显著性(P<0.05)，见Fig 4。

Fig 4 Effects of rhubarb extract treatment on Bax, Bcl-2(A), cleaved caspase-3, caspase-3(B) protein in MCAO rats n=3)##P<0.01 vs sham; **P<0.01 vs MCAO

3 讨论

缺血性脑卒中引起的血管闭塞，导致脑内缺氧和能量丧失，随后形成活性氧，释放谷氨酸，细胞内钙离子积累，并诱导炎症反应。这一系列事件，称为缺血级联，导致不可逆转的组织损伤[11]。本实验采用MCAO模型模拟缺血性脑卒中，该方法无需开颅，对动物损伤小、重复性高、再灌注时间高度可控，可以较准确地模拟临床上脑缺血病况[12]。IL-1β和iNOS是重要的促炎因子，脑中风后这些炎性细胞因子的大量产生，可以破坏神经细胞和血脑屏障以及影响神经细胞再生，促进神经炎症反应和组织损伤[13]。同时，GFAP是星形胶质细胞的特异性标志蛋白，在病理过程中产生的炎症因子刺激下，会引起星形胶质细胞活化并增殖，GFAP作为其胶质细胞损伤相关蛋白，脑损伤后也大量表达[14]；本实验证实，脑损伤后IL-1β和iNOS炎症因子基因表达显著增加，GFAP的表达也明显提高，并发现经大黄提取物干预后能逆转该结果，表明大黄提取物能降低神经炎症水平并抑制星形胶质细胞的异常活化。

TUNEL染色利用生化方法特异性标记凋亡细胞，将凋亡细胞与活细胞及坏死细胞区分开，适用于机制研究，是一种常见的细胞凋亡检测方法。采用此方法检测，结果显示大黄提取物能显著降低缺血性脑损伤后TUNEL的阳性表达。研究表明，caspase是细胞凋亡的关键介导因子，其中caspase-3是一种常被激活的死亡蛋白酶，催化多种细胞关键蛋白的特异性断裂，是细胞凋亡过程最关键的凋亡执行蛋白酶[15]。同时Bcl-2家族是细胞凋亡的主要调控因子和介导因子，家族成员中Bax和Bcl-2是细胞凋亡过程中一对相对立的调控基因，而Bcl-2/Bax的高比值则被认为是细胞抗凋亡的关键因素。本次研究发现，大黄提取物能够抑制MCAO大鼠缺血侧脑组织的凋亡蛋白酶cleaved caspase-3和Bax促凋亡蛋白表达，促进Bcl-2抗凋亡蛋白的表达，从而能够抑制MCAO大鼠脑细胞凋亡。

综上所述，大黄提取物通过降低缺血性脑损伤后的炎症水平，抑制缺血侧脑细胞凋亡，从而发挥脑保护作用。这将为课题组下一步对大黄提取物中有效成分的提取及药效机制研究奠定理论和实验基础。

(致谢：本实验在福建中医药大学药学院生物医药研发中心及省级中药学重点实验室完成，感谢所有老师及同学的支持与帮助！)