对香豆酸对急性应激诱导小鼠记忆提取障碍的改善作用

肖楚丽，李金成，李碧蓉，肖志勇，张文超，于旭东

(1. 邵阳学院基础医学院，湖南 邵阳 422000；2. 南华大学附属第一医院，湖南 衡阳 421001)

应激对记忆产生深远而多样的影响，一般来讲，一定程度的应激可增强记忆，然而应激时间过长或强度过大可损害记忆[1]。并且应激可增加个体患精神疾病的风险。然而应激对记忆影响的分子机制仍没有完全阐明。因此阐明应激影响记忆的分子机制，寻找有效的抗应激性记忆障碍的药物具有重要意义。

对香豆酸(p-coumaric acid，p-CA)是一种衍生自芳香族氨基酸的苯丙酸，广泛分布于许多植物和人类饮食中，如谷物、水果和蔬菜，具有多种药用活性，包括抗氧化、心脏保护、抗疟原虫、抗突变、抗血小板、抗炎和免疫调节作用[2-4]。在中枢神经系统中，研究表明p-CA可改善脑缺血/再灌注损伤,改善LPS诱导的抑郁样行为[5-6]。然而p-CA在学习记忆中的作用却研究滞缓，尤其是在应激性记忆障碍的作用并无报道。

应激通常诱导各种细胞信号传导途径的下调，如蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)和胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)，而抗应激治疗通过激活这些信号传导途径来拮抗应激诱导的负性影响。拮抗氧化应激可改善应激诱导记忆障碍。在细胞实验中，p-CA 可激活ERK信号改善氧化应激现象[3]。这些证据提示p-CA可能在应激性记忆障碍中发挥重要作用。为验证p-CA在应激性记忆障碍中的作用，当前研究基于急性束缚应激(acute stress, AS)诱导的新颖物体识别(novel object recognition，NOR)与物体位置识别(object location recognition，OLR)记忆提取障碍范式探索p-CA对应激性记忆障碍的影响以及可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物♂，ICR小鼠,7周龄，体质量(30～35) g，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK湘2019-0004，2只每笼，均饲养于标准实验动物环境，(23±2) ℃，12 h/12 h明暗交替中，并保证小鼠可自由摄食和饮水。所有ICR小鼠在实验处理之前饲养1周，以适应新环境。所有实验程序均完全按照国家卫生研究院关于和使用实验室动物的指南进行。

1.2 实验设计

1.2.1实验1 实验1A p-CA对AS诱导小鼠新颖物体识别记忆提取障碍的影响。小鼠随机分成对照组(Control)，急性应激组(AS)，急性应激组(AS)+p-CA组(AS+ p-CA)，每组8只，实验流程如Fig 1A所示，3组小鼠进行新颖物体识别测试流程，测试阶段开始前1.5 h开始束缚，束缚1 h后立即注射p-CA或10%的Tween 80(溶媒1)，观察小鼠在测试中的记忆表现。

实验1B p-CA对AS诱导小鼠物体位置识别记忆提取障碍的影响。小鼠随机分成对照组(Control)，急性束缚应激组(RS)和急性束缚应激+p-CA组(AS+p-CA)，每组8只，实验流程如Fig 1A所示，3组小鼠进行物体位置识别记忆测试流程，测试阶段开始前1.5 h开始束缚，束缚1 h后立即注射p-CA或溶媒1，观察小鼠在测试中的记忆表现。

Fig 1 Schematic of experimental designs in experiment 1A：Experiment 1；B： Experiment 2. AS, acute stress; p-CA, p-coumaric acid; PD, PD98059.

1.2.2实验2 实验2A PD98059对p-CA改善AS小鼠记忆障碍的影响。小鼠随机分成急性应激组(AS)，急性应激+ PD98059组(AS+PD)，急性应激+p-CA组(AS+ p-CA)和急性应激+ PD98059+p-CA组(AS+ p-CA + PD)，每组8只，实验流程如Fig 1B所示，4组小鼠进行新颖物体识别测试，测试阶段开始前1.5 h开始束缚，束缚1 h后立即注射p-CA或溶媒1，5 min后侧脑室注射PD98059或1% DMSO(溶媒2)，观察小鼠在测试中的记忆表现。

实验2B H89对p-CA改善AS小鼠记忆障碍的影响。小鼠随机分成急性应激组(AS)，急性应激+ H89组(AS+ H89)，急性应激+p-CA组(AS+ p-CA)和急性应激+ H89+p-CA组(AS+ p-CA + H89)，每组8只，实验流程如Fig 1B所示，4组小鼠进行新颖物体识别测试，测试阶段开始前1.5 h开始束缚，束缚1 h后立即注射p-CA或溶媒1，5 min后侧脑室注射H89或1% DMSO(溶媒2)，观察小鼠在测试中的记忆表现。

1.3 新颖物体识别测试新颖物体识别装置为黑色隔音箱(30 cm长×30 cm宽×50 cm高)，箱内光线柔和，并且一排气扇提供约50 Hz的噪音。识别物体为偏好相同而形状颜色不同的两个物体，识别物体通过双面胶粘贴于箱底并平衡其位于箱底的位置。

实验分为习惯化、采样和测试三个阶段，在习惯化阶段小鼠放入空隔音箱适应10 min。采样阶段在习惯化后24 h进行，隔音箱内对称放入两个相同的识别物体，小鼠放入箱中自由探索10 min。采样阶段结束后24 h进行测试阶段，采样阶段的两个相同物体被随机替换一个新物体，再次将小鼠放入探索5 min。每次放入小鼠前用75%的酒精清洁箱内。通过摄像头拍摄,记录小鼠分别探求两个物体的时间。小鼠的鼻子距物体小于1 cm则视为探索。小鼠的记忆通过测试阶段的辨别指数(DI)进行衡量。DI =(新物体的探索时间-旧物体的探索时间)/(新物体的探索时间+旧物体的探索时间)。

1.4 物体位置识别测试物体位置识别装置为黑色隔音箱(35 cm 长×25 cm宽×50 cm高)，箱内光线柔和，并且一排气扇提供约50 Hz的噪音。识别物体为形状颜色完全相同的两个物体，识别物体通过双面胶粘贴于箱底并平衡其位于箱底的位置。

实验分为习惯化、采样和测试三个阶段，在习惯化阶段小鼠放入空隔音箱适应10 min。采样阶段在习惯化后24 h进行，两识别物体放入隔音箱内分别在箱底长边的垂直平分线上并距长边4 cm处对称粘贴，小鼠放入箱中自由探索10 min。采样阶段结束后24 h进行测试阶段，随机将采样阶段的一个识别物体移动并粘贴于短边的垂直平分线上，且距短边4 cm处，再次将小鼠放入箱内探索5 min。每次放入小鼠前用75%的酒精清洁箱内。通过摄像头拍摄,记录小鼠分别探求两个物体的时间。小鼠的鼻子距物体小于1 cm则视为探索。小鼠的记忆通过测试阶段的辨别指数(DI)进行衡量。DI =(新物体的探索时间-旧物体的探索时间)/(新物体的探索时间+旧物体的探索时间)。

1.5 急性应激(AS)流程通过50 mL的离心管对小鼠进行束缚进行急性应激，离心管均匀分布直径为4 mm的透气孔以保证小鼠自由呼吸，束缚时间为1 h，束缚结束后放回鼠笼。

1.6 侧脑室置管及给药小鼠腹腔注射戊巴比妥钠(65 mg·kg-1)，待其麻醉后固定于脑立体定位仪上，暴露颅骨并标记前囟点，以前囟点为原点，将导管(62202型，瑞沃德生命科学有限公司)向后0.3 mm，向右1.0 mm向下2.5 mm植入右侧脑室。手术后，小鼠单笼饲养恢复5～7 d。实验结束后，组织解剖来确定导管位置是否正确，并剔除导管位置错误动物的数据。

1.7 药物与试剂p-CA(阿拉丁，上海)分散于10%的Tween 80(溶剂为生理盐水)中(溶媒1)，剂量为25 mg·kg-1；经腹腔注射，药物及溶媒的注射体积为10 mL·kg-1。H89与PD98059 (selleck,美国)均分散于1% DMSO(溶剂为生理盐水)中(溶媒2)，最终浓度分别为1 g·L-1和2 g·L-1。两种药物均经侧脑室微量给药，在小鼠清醒状态下用毛巾轻微束缚，然后用微量注射泵通过引导管向侧脑室注射，注射体积为1 μL，耗时约2 min，并停留1 min。

2 结果

2.1 p-CA改善AS诱导小鼠新颖物体识别记忆提取障碍在NOR采样阶段(Fig 2A)，单因素方差分析显示，各组小鼠对两物体的总探索时间无明显差异(P>0.05)。在测试阶段，各种处理均不影响小鼠对两物体的总探索时间(P>0.05,Fig 2A右)和活动距离(P>0.05,Fig 2B)，却明显影响小鼠的DI(P<0.01,Fig 2C)，具体来说，AS明显降低小鼠DI(P<0.01)，而p-CA明显上调AS诱导的DI降低(P<0.05)。

Fig 2 Effect of p-CA on NOR memory retrieval deficit induced by AS in mice n=8)A: The total time spent on exploring both objects is shown for the three groups in NOR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the three groups in NOR test section; C: The discrimination index is shown for the three groups in NOR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, NOR: novel objective recognition.**P<0. 01 vs control group;#P<0. 05 vs AS group.

2.2 p-CA改善AS诱导小鼠物体位置识别记忆提取障碍在ORL采样阶段(Fig 3A)，单因素方差分析显示，各组小鼠对两物体的总探索时间无明显差异(P>0.05)。在测试阶段，各种处理均不影响小鼠对两物体的总探索时间(P>0.05,Fig 3A右)和活动距离(P>0.05,Fig 3B)，却明显影响小鼠的DI(P<0.01,Fig 3C)，具体来说，AS明显降低小鼠DI(P<0.05)，而p-CA明显上调AS诱导的DI降低(P<0.05)。

Fig 3 Effect of p-CA on OLR memory retrieval deficit induced by AS in mice n=8)A:The total time spent on exploring both objects is shown for the three groups in OLR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the three groups in OLR test section; C: The discrimination index is shown for the three groups in OLR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, OLR: objective location recognition.*P<0. 05 vs control group;#P<0. 05 vs AS group.

2.3 PD98059阻断了p-CA对急性应激小鼠记忆提取的改善作用在NOR采样阶段结果显示，各组小鼠对两物体的总探索时间无明显差异(P>0.05)。在测试阶段，各种处理均不影响小鼠对两物体的总探索时间(P>0.05,Fig 4A)和活动距离(P>0.05,Fig 4B)，却明显影响小鼠的DI(P<0.01,Fig 4C)，具体来说，p-CA明显上调AS小鼠DI(P<0.05)，而PD98059明显降低p-CA诱导的AS小鼠DI上调(P<0.05)。此外，单独注射PD98059不影响应激小鼠DI(P>0.05)。

Fig 4 Effect of PD98059 on p-CA improved NOR memory retrieval deficit in AS mice n=8)A:The total time spent on exploring both objects is shown for the four groups in NOR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the four groups in NOR test section; C: The discrimination index is shown for the four groups in NOR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, NOR: novel objective recognition, PD: PD98059.*P<0. 05 vs AS group;#P<0. 05 vs AS+p-CA group.

2.4 H89阻断了p-CA对急性应激小鼠记忆提取的改善作用在NOR采样阶段(Fig 5A)，单因素方差分析显示，各组小鼠对两物体的总探索时间无明显差异(P>0.05)。在测试阶段，各种处理均不影响小鼠对两物体的总探索时间(P>0.05,Fig 5A)和活动距离(P>0.05,Fig 5B)，却明显影响小鼠的DI(P<0.05,Fig 5C)，具体来说，p-CA明显上调AS小鼠DI(P<0.05)，而H89明显降低p-CA诱导的AS小鼠DI上调(P<0.05)。此外，单独注射H89不影响应激小鼠DI(P>0.05)。

Fig 5 Effect of H89 on p-CA improved NOR memory retrieval deficit in AS n=8)A:The total time spent on exploring both objects is shown for the four groups in NOR sample and test section; B: The distance travelled is shown for the four groups in NOR test section; C: The discrimination index is shown for the four groups in NOR test phase. p-CA: p-coumaric acid, AS: acute stress, NOR: novel objective recognition.*P<0. 05 vs AS group;#P<0. 05 vs AS+p-CA group.

3 讨论

研究发现，p-CA可提高急性应激小鼠新颖物体测试及物体位置测试中小鼠辨别指数。此外，考虑到PKA信号和ERK信号在学习记忆中的作用，本文应用ERK抑制剂 PD98059和PKA信号抑制剂H89分别探索其对p-CA改善急性应激小鼠记忆提取障碍的作用。结果显示， H89和 PD98059分别阻断了p-CA对急性应激小鼠记忆提取障碍的改善作用。这些结果表明，p-CA改善急性应激诱导小鼠记忆提取障碍，并且这种作用可能依赖于ERK及PKA信号。

NOR及OLR测试利用啮齿类对新物体或新位置的天然偏好来检测动物记忆。其中NOR测试常用于检测动物的识别记忆，一般认为，嗅内侧皮层是控制这种记忆的关键脑区。而OLR测试常用于检测动物由海马控制的空间记忆[7]。急性应激对记忆的作用非常复杂，不同类型、强度、持续时间的应激作用于记忆的相同阶段可增强、损害记忆或对记忆无影响。相同类型、强度、持续时间的应激作用于记忆的不同阶段可增强、损害记忆或对记忆无影响[8]。急性束缚应激是一种广泛接受的啮齿动物应激模型，它引起无条件和不可避免的神经内分泌反应，其特征是外周血浆皮质酮明显升高。虽然急性束缚应激对多种记忆类型的影响不尽相同，一致的是急性束缚应激破坏NOR和OLR记忆提取过程[9-10]。故当前研究表明1 h急性束缚应激破坏小鼠NOR和OLR记忆提取过程,进一步支持了应激对记忆提取的损害作用。

p-CA在中枢疾病中发挥广泛的神经保护作用[5,6,11]。p-CA可改善小鼠氧化应激及脑缺血/再灌注损伤，炎性抑郁大鼠强迫游泳及悬尾测试中的抑郁样行为[5,6]。重要的是，p-CA可改善东莨菪碱诱导大鼠被动回避和水迷宫测试中记忆障碍[11]。一致的是，当前研究结果显示p-CA明显改善急性应激诱导的NOR记忆提取障碍，进一步研究发现p-CA可明显改善急性应激诱导的OLR记忆提取障碍，这进一步支持了p-CA的神经保护作用和扩展了p-CA的促学习记忆作用。此外，为排除活动度及探索时间等非特异性因素对实验结果的影响，在NOR及OLR测试中分别检测了小鼠的行走距离及对两物体的总探索时间，结果显示急性应激或p-CA均不影响小鼠的活动水平及探索时间，表明急性应激或p-CA不是通过影响小鼠的活动水平及总探索时间来影响小鼠记忆表现。

ERK和PKA信号传导途径参与p-CA的多种生物学作用。 具体来说，p-CA通过ERK改善氧化应激诱导细胞凋亡[3]。含有p-CA的竹茎提取物通过PKA信号发挥抗氧化应激作用[12]。PD98059为ERK信号广泛应用的抑制剂，在之前研究中双侧前额叶皮层分别注射2 g·L-1的PD98059抑制了ERK蛋白的磷酸化，且损害NOR[13]。侧脑室注射1μg的PD98059抑制ERK蛋白磷酸化[14]。当前研究中，侧脑室注射2 μg的PD98059阻断了p-CA对应激性记忆提取障碍的改善作用，可能与抑制ERK蛋白的磷酸化有关。此外，单独侧脑室注射2 μg PD98059不影响小鼠记忆提取。提示p-CA促应激性记忆提取障碍可能依赖于ERK信号。H89为PKA信号广泛应用的抑制剂，在之前研究中双侧海马分别注射5 pmol(约0.002 6 μg)的H89抑制了亚精胺对PKA蛋白磷酸化的增强作用及学习记忆的提高作用。此外,5 μmol·L-1(约2 596 μg)的H89均损害学习记忆。当前研究中，侧脑室注射1 μg的H89阻断了p-CA对应激性记忆提取障碍的改善作用，可能与抑制PKA蛋白的磷酸化有关。此外，单独侧脑室注射1 μg H89不影响小鼠记忆提取。提示p-CA促应激性记忆提取障碍可能依赖于PKA信号。基于以上研究内容，本研究进一步支持了ERK和PKA信号对p-CA生物学功能的参与作用。为进一步证实ERK和PKA在p-CA促应激性学习记忆中的作用，在将来的研究中应检测ERK和PKA总蛋白及蛋白磷酸化形式的影响以明确p-CA对ERK和PKA的激活作用及H89和PD98059对p-CA激活ERK和PKA的抑制作用。

本研究基于NOR和OLR范式，首次证明p-CA可逆转急性应激诱导记忆提取障碍，并且p-CA的这种作用可能依赖于PKA与ERK信号。此外，与其他酚类化合物相比，p-CA在肠道中被快速吸收，具有更高的生物利用度，提示其可能作为一种潜在的治疗应激性记忆障碍的药物。ERK和PKA具有广泛的下游靶点，需要在今后的研究中进一步明确其下游机制。