淀粉、脂肪、蛋白质和NaCl成分对气态ClO2杀菌效果的影响

毕秋芸

(淄博职业学院制药与生物工程系，山东 淄博 255314)

二氧化氯(ClO2)是一种具有独特气味的黄绿色气体[1]。它极易溶于水并以非水解形式形成水溶液[2]。ClO2是一种应用范围较广的杀菌剂，作为一种高选择性氧化剂，由于其独特的单电子机制，能攻击有机分子中富含电子的中心，并被还原为亚氯酸根离子[3]，其杀菌原理主要是对微生物细胞表面膜蛋白(包括参与运输的酶)进行氧化攻击[4]。ClO2能氧化酶中的巯基(—SH)和二硫化物(—S—S—)，使其生理功能失效。Young等[5]研究发现，细胞膜的损伤会使枯草芽孢杆菌的孢子失活，虽然受ClO2氧化损伤的孢子可以萌发，但不能继续生长发育。ClO2主要以分子形式存在，很容易穿透细菌细胞膜，从而改变跨膜离子梯度并抑制呼吸，同时ClO2也会破坏微生物中的蛋白质合成[6]。

气态ClO2和ClO2溶液作为消毒剂在食品杀菌领域应用非常广泛[7]。作为一种消毒剂，气态ClO2比ClO2溶液具备更多的优势，具体表现在其高氧化能力，与有机物的反应性低，在低浓度和pH 3.0～8.0的范围内杀菌效率很高，并且不会与氨、腐殖酸或其他有机前体反应形成有害的氯胺、氯酚和三卤甲烷[8]。ClO2气体还具有很强的渗透性和强溶解性，使其能够尽可能地降低食品或与食品接触面的微生物含量[9]。浓度、接触时间、相对湿度以及温度是影响气态ClO2杀菌效果的主要因素[10]。ClO2的主要缺点是由它的不稳定性而形成的无机副产物，如亚氯酸盐和氯酸盐[11]。

研究拟先确定各种食源性病原体和腐败微生物对气态ClO2的敏感性。由于腌制肉类及黄瓜、胡萝卜等加工过的蔬菜变质与肠膜明串珠菌有关，因此以肠膜明串珠菌为测试对象，探究食品中脂肪、蛋白质、碳水化合物以及氯化钠等成分，对气态ClO2杀菌效果的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

食源性微生物革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、霉菌孢子、细菌芽孢、酵母菌：中国药品生物制品检验所；

NaOH、HCl、KI、硫代硫酸钠：分析纯，成都西亚化工股份有限公司；

紫外/可见光光度计：Alpha-1900SPlus型，上海谱元仪器有限公司；

离心机：5930型，久保田商事株式会社；

显微镜：SteREO Discovery.V20型，德国卡尔蔡司公司。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株、孢子悬浮液的培养和制备 将细菌和酵母接种到5 mL无菌培养液中培养48 h，取一环培养物转移到5 mL的肉汤中培养24 h，然后将培养物保存在7 ℃的琼脂斜面上。霉菌在7 ℃的马铃薯葡萄糖琼脂上保存。分生孢子悬浮液通过将一些产孢菌丝体无菌转移到Eppendorf试管中而制成的，试管中分别填充有1 g/L细菌蛋白胨和8.5 g/L NaCl的无菌溶液，然后将0.1 mL分生孢子悬浮液分散在PDA平板上。通过Marquenie等[12]的方法从培养皿中获得孢子。用5 mL无菌0.3 g/100 mL吐温-20溶液洗涤每个平板，并用无菌玻璃棉过滤孢子悬浮液两次，去除菌丝碎片，然后，滤液在3 700×g下离心15 min。将沉淀的孢子重新悬浮于4 mL pH 7.2的无菌磷酸盐缓冲液(10 mmol/L)中。

为了制备蜡状芽孢杆菌孢子的悬浮液，按照Gaillard等[13]的方法制备产孢培养基。分别将1 mL浓度40 mg/L MnSO4灭菌溶液和浓度100 mg/L CaCl2灭菌溶液添加到1 L的营养琼脂中，然后，倒入培养皿，接种100 μL 经24 h培养的蜡样芽胞杆菌。温育4 d后，用无菌拭子刮平培养皿，用10 mL蛋白胨/NaCl溶液摇匀。将孢子悬浮液加热至80 ℃保持10 min以破坏营养细胞。最后通过显微镜检查孢子悬浮液的萌发孢子。

1.2.2 气态ClO2处理 图1为ClO2气体处理系统示意图，处理系统包括汽提塔、处理室和取样装置(图1C)。汽提塔通过塑料管与处理室相连，处理室包含12个培养皿。通过温湿度计测量室内的温度和相对湿度。在左侧与采样设备建立了连接。穿孔管保证了室内ClO2气体的分布。将用于处理的培养皿放置在入口管上方的穿孔塑料板上(图1A和B)。柜盖中央的风扇保证了ClO2的快速均匀分布。

图1 ClO2气体处理系统示意图Figure 1 Diagram of the ClO2 gas treatment system

12个培养皿可以同时处理。每次处理前，通过4 L/h的热湿空气流将处理室内的相对湿度调节至90%以上，温度控制为(25±3) ℃。通过水浴法将0.01%的ClO2溶液加热至48 ℃，并通过压缩空气将ClO2从溶液中分离出来。每0.5 min对试验箱中的空气采用空气取样泵进行取样，以1 L/min的速率从试验箱中取出样品。在处理室和取样泵之间连续放置两个含有25 mL 7 g/100 mL KI缓冲溶液(pH 7.0)的洗涤瓶，使得含有ClO2的空气被吸入碘化钾溶液。定量转移两个洗涤瓶的样品并添加3 mL HCl (6 mol/L)溶液，用0.002 mol/L 硫代硫酸钠滴定混合物至无色终点，以1 g/100 mL可溶性淀粉为指示剂。

⑰黄亚平:《“新型城镇化”概念内涵、目标内容、规划策略及认知误区解析》，《城市规划学刊》2013年第2期。

处理结束后，打开盖子，取出培养皿。在初步试验后选择ClO2气体浓度和处理时间，以确定阈值并进行量化分析。

1.2.3 微生物对气态ClO2的敏感性 分别在琼脂平板上接种100 μL的细菌、酵母菌、霉菌孢子悬浮液。在室温下放置30 min后，于1 min(0.5 min供气+0.5 min取样时间)内用ClO2处理6个接种板。3个未经处理的琼脂平板作为对照。

1.2.4 不同食物成分对ClO2杀菌效果的影响 肠膜明串珠菌的原代培养物在7 ℃的胰蛋白胨大豆琼脂斜面上保存，将接种物转移到5 mL MRS肉汤培养基，并于30 ℃ 下孵育24 h。

为了研究可溶性多糖的影响，在MRS琼脂中加入浓度为0，1，10，30 g/100 mL的可溶性淀粉。同样，用浓度为0，1，3，5 g/100 mL NaCl制备平板培养基。用玉米油和未加盐的黄油研究油脂存在的影响。玉米油、熔融态黄油和MRS琼脂在121 ℃下分别蒸压15 min。冷却到48 ℃后，将玉米油和黄油添加到琼脂中，以获得最终的油脂浓度为1，10，30 mL/100 mL。随后，添加Tween-20以稳定这些乳剂，使其最终浓度达到0.005 mL/100 mL。为了研究蛋白质存在的影响，采用pH为5.0～5.2的等电点乳清蛋白、含85%β-乳球蛋白和15%α-乳清蛋白(浓度分别为0，1，7 g/100 mL)进行研究。当乳清蛋白分离物浓度较高时，MRS琼脂不能正常固化，将乳清分离蛋白粉末以干粉形式分别蒸压(15 min，121 ℃)。将经过调质的MRS琼脂添加到蛋白质粉末中，以获得所需的蛋白质浓度。

1.2.5 微生物分析 将每个培养皿中的琼脂转移到无菌袋中，进行稀释并将稀释液涂在琼脂培养基上，用MRS琼脂平板进行食品成分试验。在30 ℃下孵育2 d后记录菌落总数。

1.2.6 ClO2处理对乳液过氧化物值的影响 以浓度为0.005 mL/100 mL 的吐温-20为乳化剂，制备浓度为0%，1%，10%或30%玉米油乳液，并以0.005%吐温-20溶液为对照。用Gray[14]的方法测定各乳液处理前后的过氧化值。将5 mL 各种样品乳液溶解在10 mL氯仿/乙酸混合液中(体积比为2∶3)。然后，加入3 mL 14 g/100 mL 的KI溶液，将混合物置于黑暗中1 min。加入20 mL 1 g/100 mL的淀粉溶液作为指示剂后，用0.01 mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定混合物至无色终点，得到样品中的过氧化值。

1.2.7 ClO2处理对乳清蛋白分离物中羰基含量以及—SH 和—S—S—基团的影响 将1%和7 g/100 mL乳清蛋白分离液处理为乳状液，并于5 000×g离心8 min。分别经ClO2(1.38 mg/L)处理10 min以及ClO2(0.08 mg/L)处理1 min后，测定溶液中羰基含量。1%乳清蛋白分离液经ClO2(1.38 mg/L)处理10 min后，检测其—SH和—S—S—的含量。

1.2.8 统计分析 用SPlus 7.0软件进行所有的统计分析工作。由于数据的非正态性，使用非参数Krus-kal-Wallis检验分析经ClO2处理后获得的微生物减少量。使用Mann-Whitney检验比较两组试验之间的平均微生物减少量。这两种分析方法目的均是为了研究食物成分对ClO2杀菌效果的影响，以及ClO2处理对过氧化物值和羰基的影响。为了确定处理前后—SH和—S—S—含量差异的显著性，采用假设方差相等和不相等的t检验。

2 结果与分析

2.1 常见食物微生物对气态ClO2的敏感性

表1显示了在室温和相对湿度(90.0±0.5)%环境下，用(0.08±0.02) mg/L ClO2对微生物处理1 min后，各类微生物的平均减少量情况。除荧光假单胞菌受ClO2的影响较小，其他革兰阴性菌和革兰阳性菌的平均下降量分别为3.5，2.6 lg (CFU/cm2)。酵母菌的平均下降量为1.1 lg (CFU/cm2)，而蜡样芽孢杆菌和霉菌孢子的平均下降量很小。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的平均下降量差异显著。除荧光假单胞菌和革兰氏阳性菌外，酵母菌对ClO2抗性显著高于革兰氏阴性菌类的其他细菌，但低于霉菌孢子和蜡样芽胞杆菌。

一般来说，革兰氏阴性菌对ClO2的抗性优于革兰氏阳性菌，而酵母菌表现出中等抗性，霉菌孢子和蜡样芽孢杆菌是最具抗性的微生物。然而，荧光假单胞菌却表现出非常优异的抗性，表明用ClO2处理荧光假单胞菌引起的腐败是很困难的。此外，虽然尽可能的控制ClO2处理微生物的过程，但大多数的微生物对数减少率的基本偏差在0.5以上。基本偏差可能是由于工艺参数的变化影响，如ClO2汽提程度、相对湿度、温度和室内气体的分布。

表1 ClO2处理过的微生物平均减少量

目前关于气态ClO2对食源性微生物杀菌作用的影响相关研究很少。据Han等[16]的研究报道，相比于乳酸菌，气态ClO2更容易灭活酵母菌和霉菌的混合物。Reina等[17]研究了ClO2溶液对各种腐败微生物的影响，根据其研究，ClO2溶液对酵母菌和霉菌的灭菌效果更为理想。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌对ClO2气体抗性的不同，可能是由于革兰氏阴性菌具有易于被ClO2穿透的板网肽聚糖细胞壁结构，而革兰氏阳性菌细胞壁是三维网状结构。

2.2 食物成分对气态ClO2杀菌效果的影响

图2显示了在室温和相对湿度(90.0±0.5)%的环境氛围下，不同浓度的可溶性淀粉、氯化钠、乳清蛋白分离物、玉米油及黄油对气态ClO2[浓度(0.08±0.02) mg]处理肠膜明串珠菌的影响。

由图2(a)可知，可溶性淀粉的存在对ClO2的杀菌效果没有显著影响。然而，添加相同浓度淀粉的琼脂培养基在试验1和试验2之间，微生物减少量变化约为1 lg (CFU/cm2)。由图2(b)可知，试验1中，含有不同浓度NaCl的琼脂培养基经ClO2处理后的微生物减少量差异不大。而在试验2中，未添加NaCl的琼脂培养基和添加5% NaCl的琼脂培养基菌落数相差约2 lg (CFU/cm2)。由图2(c)可知，乳清蛋白对ClO2的杀菌效果影响显著。1%浓度的乳清蛋白使ClO2的抑菌效果显著降低，而用7%的乳清蛋白和1%的乳清蛋白对二氧化氯的抑菌效果影响差不多。由图2(d)和(e)可知，相对较低的玉米油或黄油浓度(1%)显著降低了ClO2的杀菌效果。将黄油浓度从1%提高到10%对ClO2的抑菌效果没有显著影响，而30%则显著降低了ClO2的抑菌效果。

虽然，在MRS琼脂中添加淀粉或NaCl对ClO2的杀菌效果影响不大。但低浓度的油脂或蛋白质明显降低了ClO2的杀菌作用。

目前还没有关于食品成分对ClO2杀菌效果影响的研究报道，但食品成分对臭氧杀菌效果的影响已经得到了证实。与试验结果相似，富含蛋白质的食物基质如牛血清白蛋白、酪蛋白酸盐、牛奶或肉汤降低了臭氧的杀菌作用[18]，鲜奶油也会降低臭氧的杀菌作用[19]。蛋白质和脂质也降低了脉冲强光的杀菌作用。碳水化合物则根据微生物的不同而对杀菌的影响也不同[20]。

2.3 ClO2对油脂过氧化值和和乳清蛋白中羰基含量及—SH、—S—S—基团浓度的影响

在室温及相对湿度为(90.0±0.5)%环境氛围用ClO2处理1 min后，ClO2对玉米油乳剂过氧化值和乳清蛋白中羰基和—SH和—S—S—基团的影响如表2所示。从表2可以看出，用0.08 mg/L ClO2处理玉米油乳液1 min 后，所有乳剂的过氧化值都显著增加。在0.08 mg/L ClO2处理下，1%和7%乳清蛋白溶液的羰基含量没有显著增加，但1.38 mg/L ClO2处理后，羰基含量显著增加，1%乳清蛋白溶液的羰基含量增加了6倍以上，而7%乳清蛋白溶液中羰基含量的上升不太明显，但仍达到145%。使用1.38 mg/L ClO2处理10 min后，1%乳清蛋白溶液中的—SH基团显著降低，而总巯基量没有显著降低。研究结果表明，用1.38 mg/L ClO2处理后能够诱导—SH到—S—S—的半转化。

U. 接种但未经ClO2处理的参考样品 T. 经气态ClO2处理的接种样品图2 食物成分对气态ClO2杀菌效果的影响Figure 2 Effects of food components on the antimicrobial activity of gaseous ClO2

表2 ClO2对玉米油乳剂过氧化值和和乳清蛋白中羰基含量及—SH、—S—S—基团浓度的影响†

ClO2的杀菌性能受蛋白质和脂肪的影响很大。原因是ClO2的强氧化特性及能与许多有机化合物进行反应。油脂存在时抗微生物效果降低可能是由于油脂中抗氧化剂(如油中的生育酚)和ClO2发生反应所致[21]。3种不饱和脂肪酸(油酸、亚油酸和亚油酸)约占玉米油脂肪酸含量的85%，而黄油主要含有饱和脂肪酸。鉴于ClO2氧化脂肪酸的程度与油脂中的双键数量密切相关，而1%的脂肪已经提供了足够的反应性位点，以消除0.08 mg/L ClO2处理的杀菌作用[22]。因此1%的黄油和1%的玉米油对ClO2杀菌效果的影响程度十分相似。这一点已被油—水乳剂的过氧化值的显著增加所证实。

乳清蛋白显著降低了ClO2的杀菌作用。ClO2会与酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸以及含硫氨基酸半胱氨酸和三肽谷胱甘肽发生反应，从而消耗了可用作消毒剂的ClO2的量[23]。乳清蛋白分离物含有质量分数约5%的含硫氨基酸。经过ClO2处理后，由ClO2诱导的蛋白质构象变化会促使芳香族氨基酸暴露，并可能导致还原的巯基(SH)基团增加暴露[24]。这项研究证实了ClO2增加了羰基含量并将—SH基团转变为—S—S—基团，然而，浓度为1.38 mg/L的ClO2可显著提高羰基含量和降低—SH 含量，而较低浓度的ClO2则有明显的灭活作用。

3 结论

淀粉、NaCl对气态ClO2的杀菌效果影响不大，而油脂和蛋白质则显著降低了ClO2的杀菌作用。因此，在处理富含蛋白质和/或脂类的食品(如肉和鱼制品)时，与富含碳水化合物的食品(如面包房产品、蔬菜和水果)相比，气态ClO2的杀菌效果较差。由于细菌芽孢、酵母菌、霉菌和假单胞菌是富含蛋白质和/或脂类的食品腐败的重要原因，因此需要较长的接触时间和/或高浓度的ClO2来灭活这些更具抗性的微生物。