虎杖膏HPLC指纹图谱研究

陈婷婷，欧水平，陈忠静，王 森，王玉和

(1.遵义医科大学 药学院，贵州 遵义 563099；2.遵义医科大学附属医院 药剂科，贵州 遵义 563099)

虎杖膏是将虎杖细粉、冰片、固体石蜡和麻油组成的一种油膏剂，是外科、皮肤科常用的中药外用制剂，由遵义医科大学附属医院自主研发制成。对于红肿而未溃烂的疮、痈、疔、疖以及软组织损伤、痛风等有很好的治疗效果，在院内使用多年，疗效明显[1-5]。该制剂的君药是虎杖，属于蓼科蓼属植物虎杖(PolygonumcuspidatumSieb.etZucc)的干燥茎和根，其性质微寒、味道微苦，归属于肝、胆、肺经。具有利湿退黄、清热解毒、散瘀止痛等功效[6-8]。虎杖主要含有白藜芦醇和虎杖苷等二苯乙烯类和大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷等蒽醌类化学成分[9-13]。虎杖含有的活性成分多、质量控制难度大。赵萍等采用HPLC测定了虎杖膏中虎杖苷、白藜芦醇、大黄素和大黄素甲醚4种成分的含量[14]，刘慧文[15]、袁萍[16]等做过虎杖的指纹图谱研究，但目前尚未有关于虎杖膏的指纹图谱报道。本研究拟建立虎杖膏的HPLC指纹图谱，以为该制剂全面有效的质量控制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器 Agilent 1260 HPLC仪，含DAD检测器(美国Agilent公司)；BT125D电子天平(德国Sartorius公司)； ME204E电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；Exceed-Cd-20型实验室超纯水机(成都艾科水处理设备有限公司)；HH-S6二列方孔水浴(郑州长城科工贸有限公司)；TD5A-WA型离心机(上海卢湘仪离心机仪器有限公司)。

1.2 试药 虎杖膏[遵义医科大学附属医院药剂科自制，批号：20171229、20180118、20180119、20180124、20180125、20180213、20180320、20180321、20180327、20180328、20180816、20180823、20180828，(S1-S13)规格：40 g/盒]；虎杖苷对照品(批号：AF8071101，纯度：99.87 %)、大黄素对照品(批号：AF7021741，纯度：98.89 %)、芦荟大黄素对照品(批号：AP7112011，纯度：98.57 %)、白藜芦醇(批号AP7091921，纯度：99.88 %)、大黄素甲醚(批号：AP7081509，纯度：99.85 %)、大黄酸(批号：AP8041804，纯度：99.49 %)、大黄素-8-葡萄糖苷(批号：PRF9050423，纯度：97.00 %)，均购自成都埃法生物科技有限公司；色谱级乙腈，购自瑞典欧森巴克化学公司；重蒸水，其他试剂均使用AR级试剂。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件[14]色谱柱：Ultimate XB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1 %磷酸水溶液，梯度洗脱程序：0～15 min：乙腈15 %～20 %，15～25 min：乙腈20 %～30 %，25～40 min：乙腈30 %～50 %，40～41 min：乙腈50 %～70 %，41～51 min：乙腈70 %～80 %，51～60 min：乙腈80 %；流速：1.0 mL/min；检测波长：286 nm；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

1.3.2 虎杖膏的制备 参考文献方法制备[1]，按40 g/盒规格分装，冷却至室温，即得虎杖膏样品。

1.3.3 混合对照品溶液的制备 分别精密称取虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄素甲醚对照品适量，置于10 mL容量瓶中，加65 %乙醇稀释定容，得到各单个对照品母液，从各对照品母液中各取1 mL到10 mL容量瓶中，用65 %乙醇稀释定容，制成每1 mL分别含虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄素甲醚59.5、6.2、21.6、31.0、31.0、30.2、30.0 μg的混合对照品溶液。

1.3.4 供试品溶液的制备 称取虎杖膏5 g，进行脱脂处理，精密称取脱脂后的虎杖膏0.1 g，加65 %乙醇30 mL， 超声处理20 min(功率50 Hz)，2 000 rpm离心10 min，精密吸取上清液2.5 mL，加65 %乙醇定容至10 mL，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2 结果

2.1 精密度试验 取一份“1.3.4”项制备的供试品溶液，进行6次连续测定，得到供试品溶液HPLC图。以虎杖苷的保留时间和峰面积为参照，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，20个共有峰的相对保留时间的RSD为1.21 %～1.24 %(n=6)，相对峰面积RSD 为2.38 %～2.97 %(n=6)。表明仪器精密度良好。

2.2 稳定性试验 取“1.3.4”项制备的同一供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24 h进样测定。结果，各共有峰的相对保留时间的RSD为1.21 %～1.25 %(n=6)，相对峰面积RSD范围为1.79 %～2.63 %(n=6)。说明供试品溶液的稳定性良好，在24 h内趋于稳定。

2.3 重复性试验 精密称取同一供试品溶液，共6份，再按“1.3.1”项下色谱条件进样测定。结果表明，20个共有峰的相对保留时间的RSD为1.20 %～1.22 %(n=6)，相对峰面积RSD 为2.27 %～2.89 %(n=6)，表明供试品处理方法重复性良好。

2.4 指纹图谱的建立

2.4.1 参照峰的选择 在HPLC图谱中，3号峰分离度良好，峰面积稳定，经与对照品对照为虎杖苷。故选择其为参照峰(见图1)。

A：混合对照品；B：样品溶液；C：空白对照；D：阴性对照图；3.虎杖苷；6.白藜芦醇；8.大黄素-8-葡萄糖苷；15.芦荟大黄素；16.大黄酸；17.大黄素；20.大黄素甲醚。图1 HPLC图

2.4.2 HPLC指纹图谱的生成 用13个批次虎杖膏样品适量，按“1.3.4”项下方法制备供试品溶液，再按色谱条件进样测定。依据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)比对分析13批虎杖膏样品所测出的HPLC图谱。以S1样品为参照图谱，多点校正后自动匹配，生成对照图谱(R)，13批样品含有20个共有峰，详见图2。

图2 13批虎杖膏样品的指纹图谱

2.4.3 相似度分析 根据2012版指纹图谱相似度评价系统生成13批虎杖膏指纹图谱共有模式，经色谱峰自动匹配，对13批样品的HPLC图谱进行比较分析以及整体相似性评价。结果，13批虎杖膏样品(S1～S13)相似度范围为0.953～0.992，表明13批样品质量稳定，详见表1。

表1 13批虎杖膏样品相似度评价结果

2.4.4 共有峰相关数据分析 依据《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》(2012版)，对13批虎杖膏样品所测出的HPLC图谱进行比对分析。结果，13批样品有20个共有峰。指认了7个共有峰，分别为虎杖苷(3号峰)、白藜芦醇(6号峰)、大黄素-8-葡萄糖苷(8号峰)、芦荟大黄素(15号峰)、大黄酸(16号峰)、大黄素(17号峰)、大黄素甲醚(20号峰)。计算其它共有峰相对于虎杖苷的相对保留时间和相对峰面积，详见表2和表3。

表2 13批虎杖膏共有峰的相对保留时间

表3 13批虎杖膏共有峰的相对峰面积

3 讨论

3.1 色谱条件的优化 本实验参考了相关文献中对虎杖相关成分的色谱条件和测定波长[14]，在286 nm波长处检测到的色谱峰最多。色谱图显示基线平稳，检测限也能满足各含量测定要求。且各峰的分离度和峰形均较好，因此选择286 nm作为本实验的最佳检测波长。实验中发现，所测溶液中的全部成分都在60 min之前出峰，之后没有相关色谱峰出现。故此选择60 min 作为检测时间。

3.2 指纹图谱相似度评价 选取13批2017年12月至2018年8月间制备的虎杖膏样品，采用HPLC进行测定，以二苯乙烯类和蒽醌类成分作为评价指标，借助《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，创建虎杖膏HPLC色谱指纹图谱及对照指纹图谱。其分离度和重复性良好，为虎杖膏提供了质量监控手段。比较虎杖膏样品指纹图谱，可以看出收集来的13批虎杖膏指纹图谱中共有20个共有峰，共有峰的整体图貌基本一致。经与对照品比较，确定了其中7个峰的归属，分别为虎杖苷、白藜芦醇、大黄素-8-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素和大黄素甲醚。其中3号峰即虎杖苷分离度良好，峰面积稳定，故选择其作为参照峰。

通过对虎杖膏指纹图谱的研究，13批虎杖膏样品的相似度范围为0.953～0.992，表明不同批次虎杖膏所含化学成分基本一致，所创建的指纹图谱的技术指标稳定、重复性较好，实验方法简便、快捷，能够较好地反映虎杖膏中化学成分的特征，为深入研究虎杖膏活性成分的积累及变化规律，全面评价虎杖膏和其它含虎杖制剂的质量提供了一种有效手段。