直立型扁蓿豆幼苗对不同盐胁迫的生理生化响应

谷 蕊，苏德毕力格，石凤翎，*，王桂花，杨 蕾，刘 扬

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.内蒙古农业大学生命科学学院，内蒙古呼和浩特 010019)

近年来内蒙古地区土地呈盐碱化趋势严重，适宜种植的耐盐性品种缺乏[1]。直立型扁蓿豆[Medicagoruthenicus(L.) Sojak cv.Zhilixing]为从野生扁蓿豆种质材料中选育出的新品种[2～3]，具有一定的耐盐性，是改良同属牧草抗逆性的优质基因资源[4]。国内外研究学者对扁蓿豆的遗传多样性和抗逆方面都进行了大量研究[5～8]，但对扁蓿豆耐盐性研究主要集中在不同品种、不同来源的扁蓿豆之间的耐盐性比较和单盐对扁蓿豆种子萌发、苗期的影响[9～11]方面，而对扁蓿豆在不同盐类型尤其是复盐的胁迫响应研究较少。盐碱化土壤中的盐碱离子并非单一离子，而是多种离子共存或互作影响着植物的生长，地区间存在差异[1]。内蒙西部盐碱土土壤盐分以硫酸盐和氯化物为主[12]，而东部地区盐碱土盐分主要为碳酸钠和碳酸氢钠[13]，利用单盐胁迫植物响应的结果并不能全面反映其耐盐性及对各类盐碱土的适应能力。因此，通过不同盐离子胁迫探讨直立型扁蓿豆对复盐胁迫的耐受程度，研究不同盐胁迫环境中直立型扁蓿豆幼苗的生长及生理变化规律，明确其半致死的复盐浓度，可为直立型扁蓿豆在内蒙古盐碱地上的种植和推广应用提供理论依据，具有重要的意义。

1 材料与方法

试验在内蒙古呼和浩特市内蒙古农业大学温室进行。直立型扁蓿豆种子为2017年收获的种子，采用花卉营养土盆栽法，待其幼苗生长至4～6叶期时进行盐胁迫。

1.1 盐胁迫处理

试验胁迫用盐为NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3，设NaCl单盐(N1)、NaCl+Na2SO4(1∶1)复盐(N2)、Na2CO3+NaHCO3(1∶1)复盐处理(N3)和对照(CK)共4个处理。先通过50～250mmol/L的NaCl溶液做预处理，根据半致死浓度，在其前后设置各类盐处理的浓度梯度(±50mmol/l)，以中性水为对照。处理后14d取相同部位叶片进行幼苗生长高度及生理指标的测定，每处理三次重复。

1.2 生理指标的测定

取不同处理幼苗同一生长部位完全展开的叶片(各指标称取0.2g)放入冰盒保存，进行生理指标的测定：丙二醛(MDA)采用硫代巴比妥酸法测定；脯氨酸选用酸性茚三酮法测定；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)的测定按照赵世杰等(2016)的方法进行[14]。

2 数据处理

利用Excel 2010和SPSS 20.0软件进行试验数据的统计与分析。

3 结果与分析

3.1 不同浓度NaCl胁迫下的幼苗成活率

由表1可知，直立型扁蓿豆受NaCl单盐胁迫后，在100mmol/L下幼苗成活率均达到100%，但随着盐浓度继续升高幼苗成活率逐渐下降，200mmol/L时幼苗的成活率降至56%(接近半致死)，当盐浓度达到250mmol/L时幼苗全部死亡。

表1 不同浓度NaCl溶液(mmol/L)胁迫下直立型扁蓿豆幼苗的成活率(%)

3.2 不同盐胁迫对幼苗生长的影响

3.2.1不同盐处理对幼苗生长速率的影响

试验表明，直立型扁蓿豆幼苗的生长在三种盐胁迫下均受到抑制(图1)，其中N3的生长最为缓慢，显著(P<0.05)低于其余两种处理。当盐浓度升高到150mmol/L时，N1胁迫的幼苗生长速率显著高于其余两种处理；在盐浓度为200mmol/L时，三种盐胁迫均对直立型扁蓿豆幼苗生长产生严重的抑制作用，植株生长速率均在0.29cm/d以下，且三种盐胁迫间无显著差异。

3.2.2叶绿素含量对不同盐处理的响应

如图2所示，直立型扁蓿豆幼苗在三种盐胁迫下叶绿素含量的变化规律不一致，但叶绿素含量均低于CK。在N1胁迫后叶绿素含量随着盐浓度的增加呈现先升高后降低，且各浓度间叶绿素含量存在显著差异；而在N2和N3胁迫时是随着盐浓度的升高呈降低趋势，N2胁迫只在200mmol/L时与其他两种浓度有显著差异，N3胁迫中各浓度间未见显著差异。比较三种类型的盐对直立型扁蓿豆幼苗胁迫后叶绿素含量的影响发现，三种盐在同一浓度下叶绿素含量均无显著差异。由此说明，三种盐胁迫对叶绿素含量的影响不存在差异。

3.3 不同盐处理对幼苗生理生化指标的影响

3.3.1不同盐处理下丙二醛含量的变化

如图3所示，直立型扁蓿豆幼苗叶片丙二醛(MDA)含量在三种盐胁迫下变化规律一致，均随盐浓度的增加而升高，且高于CK。在三种盐胁迫下，当盐浓度为100mmol/L和150mmol/L时，各胁迫叶片内MDA含量增加未见显著差异，说明在这两种浓度下细胞膜系统受到的损伤不明显；盐浓度达到200mmol/L时，叶片内MDA含量明显升高，N2显著高于其他两种胁迫(P<0.05)，说明在N2胁迫下直立型扁蓿豆幼苗细胞膜系统的损伤最严重，植株对自身的保护性也最为明显。

3.3.2游离脯氨酸含量对不同盐处理的响应

在三种盐胁迫下，植物叶片游离脯氨酸含量均随盐浓度的增加而升高，均高于CK(如图4)。在N1胁迫下，随着盐浓度的增加游离脯氨酸含量显著增加。当盐浓度为100mmol/L时，各胁迫叶片内游离脯氨酸含量增加较小，说明此浓度下植物细胞液泡中的平衡还未被该浓度中的盐分打破，未有显著差异(P>0.05)；盐浓度达到200mmol/L时，叶片内游离脯氨酸含量升高明显，N1显著高于其他两种胁迫(P<0.05)，说明单盐胁迫下直立型扁蓿豆幼苗中细胞平衡被高浓度的盐分破坏，植株自身为避免细胞质脱水积累了大量游离脯氨酸来进行细胞渗透调节。

3.3.3超氧化物歧化酶活性对不同盐处理的响应

在三种盐胁迫下，直立型扁蓿豆叶片中的超氧化物歧化酶(SOD)酶活性随着盐浓度增加变化不明显(图5)。同种浓度下SOD酶活性进行比较，N1和N2高于CK，N3低于CK。当盐浓度为100mmol/L时，各胁迫叶片内SOD酶活性较小，各处理间未有显著(P>0.05)差异；当盐浓度在150mmol/L时，N2的SOD酶活性要显著高于N1和N3(P<0.05)，N1和N3间有显著(P<0.05)差异；当盐浓度达到200mmol/L时，N1高于其他两种胁迫，各胁迫间未见显著差异(P>0.05)。

3.3.4过氧化物酶活性对不同盐处理的响应

在三种盐胁迫下，植物叶片的过氧化物酶(POD)活性均高于CK，并随盐浓度的增加而降低(图6)。在N1胁迫时，各浓度未见显著差异；在N2胁迫下，当盐浓度升高到150mmol/L时POD酶活性开始显著下降；在N3胁迫下，当盐浓度升高到200mmol/L时POD酶活性才显著降低。当盐浓度为100mmol/L和150mmol/L时，N3叶片内POD酶活性显著(P<0.05)高于其他两种盐处理，这表明直立型扁蓿豆幼苗在N3胁迫下产生POD酶来清除细胞内的H2O2，以抵抗盐胁迫带来的伤害，但可能是已经超过植物耐盐的浓度，所以POD酶活性呈下降趋势；当盐浓度达到200mmol/L时，叶片内POD酶活性下降显著，N2显著(P<0.05)低于其他两种处理。

3.4 盐浓度和盐种类对幼苗影响作用的比较

通过对不同盐及其浓度进行双因素方差分析(表2)发现，盐浓度、盐种类及两者的互作均对生长速率、游离脯氨酸、POD这些生长和生理指标具有极显著的影响，而叶绿素含量对不同盐及浓度的互作、MDA和SOD受盐浓度和盐种类的影响均不明显。MDA受盐浓度和盐种类的响应不明显，可能与盐胁迫逆境对直立型扁蓿豆幼苗细胞膜透性影响不大有关；SOD酶活性未见显著差异，这可能是直立型扁蓿豆本身将O2-转化为水的机制与其他植物的不同，也可能是盐浓度未达到相应的极限，导致其受盐浓度和盐种类的影响不显著。

表2 直立型扁蓿豆幼苗盐胁迫中不同盐及浓度的双因素方差分析

4 讨论

4.1 直立型扁蓿豆对盐溶液的耐受性

近年来，有许多学者对扁蓿豆的耐盐性进行了测定。钟华等[15]对扁蓿豆盐胁迫的研究表明，扁蓿豆所能承受的NaCl和Na2CO3的浓度不宜超过400mmol/L；姚佳[11]在对扁蓿豆耐盐性的测定中发现，在NaCl浓度300mmol/L时扁蓿豆的生长已经受到了严重的影响；潘涛涛[16]对12份扁蓿豆幼苗材料的耐盐性进行的比较表明，在NaCl浓度300mmol/L时所测指标中受到的抑制程度最大；Guan等[10]对直立型扁蓿豆的种子在盐胁迫下的发芽情况进行了研究，表明在NaCl浓度为250mmol/L时种子的发芽率低于20%，在盐浓度为200mmol/L时种子发芽率低于40%。以上研究结果表明，扁蓿豆均在盐胁迫浓度为200～400mmol/L时受到影响，但未明确表明扁蓿豆的盐耐受能力。本试验在对直立型扁蓿豆的耐盐浓度的选择中，以其经过NaCl单盐胁迫后幼苗成活率为依据，结果表明盐浓度在200mmol/L时直立型扁蓿豆生长受到抑制，为其半致死浓度；在盐胁迫浓度为250mmol/L时，幼苗完全死亡。根据前人单盐胁迫结果也可粗略判断，直立型扁蓿豆较野生扁蓿豆材料的耐盐性弱。

4.2 盐离子对直立型扁蓿豆幼苗生长形态的影响

生长抑制是植物本身受盐胁迫影响最敏感的表现。植物生长在盐碱性环境中，盐离子对植株形态发育产生显著的影响，抑制植物的生长[17]。植物在经过盐胁迫后，盐分会对植株造成不同程度的伤害，在阳离子中，钠盐的毒害作用大于钙盐；阴离子中，CO32-的毒性大于Cl-和SO42-[18]。同时，植物进行离子吸收时，植物细胞内会有维持细胞内离子动态平衡，额外的盐分会干扰植物体内的离子动态平衡，对植株造成毒害，严重影响植物的正常生长[19～20]。本试验通过对三种不同单盐和复盐对直立型扁蓿豆幼苗的胁迫影响进行比较，发现Na2CO3和NaHCO3复盐对直立型扁蓿豆的生长抑制程度最大，可能是直立型扁蓿豆幼苗受CO32-和HCO3-离子的影响要大于其他两种盐中Cl-和SO42-,这与钟华[15]在扁蓿豆耐盐性研究中有关扁蓿豆受Na2CO3影响显著的结果一致。

叶绿素作为光合作用的主要成分，其含量的多少会直接影响植物的生长情况，可以作为衡量植物抗逆性的一个重要指标[21]。有研究表明，盐胁迫会使叶片内光合色素发生降解，导致叶绿素数量减少，造成光合反应过程受阻，进而通过影响植物光合作用来限制植株的生长[22～23]。目前，关于盐胁迫对植物叶绿素含量的影响还存在异议，有研究结果表明叶绿素含量会随着盐胁迫浓度的增加而降低[24,26]，而另一些研究发现叶绿素含量随着盐胁迫浓度的增加先增大后减小[23，25]，有的研究还认为叶绿素含量会随着盐胁迫浓度的增加逐渐升高[26，28]。本研究结果显示，在NaCl胁迫时叶绿素含量随着盐胁迫浓度的增加呈先升高后降低的趋势，这可能是叶绿素的合成需要脯氨酸，而在盐胁迫下细胞中大量积累脯氨酸就有利于叶绿素的合成[20]，本研究中NaCl胁迫时积累的脯氨酸均高于其他两种盐胁迫，因此叶绿素含量随着盐胁迫浓度的增加先升高后降低。在NaCl、Na2SO4复盐和Na2CO3、NaHCO3复盐胁迫下，叶绿素含量随着盐胁迫浓度的增加呈降低的趋势，可能与盐胁迫影响光合反应过程中相关酶类的含量或活性有关[29～30]，这与杜军华等盐胁迫对蚕豆中叶绿素的研究有相似的结论[29]。

4.3 盐离子对直立型扁蓿豆幼苗细胞膜渗透物及酶活性的影响

为避免或减少植物体遭受伤害，植物体内存在抗氧化的过氧化酶系统，主要包括SOD、POD、CAT(过氧化氢酶)等[33]。POD为植物体内重要的抗氧化酶，在逆境中可有效地清除活性氧，防御活性氧或其他过氧化自由基对细胞膜系统的伤害，以减轻逆境胁迫对植物的伤害[34]。在一定的范围内，随着盐浓度的增加POD酶活性呈现下降趋势。本试验中，直立型扁蓿豆在Na2CO3和NaHCO3胁迫下的变化要较其他两种盐影响较大，可能是在植物受到Na2CO3和NaHCO3盐胁迫时通过积累脯氨酸来防止蛋白质结构受到破坏以及稳定酶结构与活性的功能[35]，可以保证叶片具有较高的POD，这与直立型扁蓿豆在100mmol/L和150mmol/LNa2CO3和NaHCO3盐浓度下的POD含量显著高于其他两种盐的结果一致。但POD的活性是呈现下降趋势，说明其抗氧化能力逐渐衰退，这与武德在碱式盐胁迫绒毛白蜡保护酶系统的影响中含有Na2CO3和NaHCO3的碱式复盐影响POD的结果基本一致[36]。随着胁迫浓度增加到200mmol/L，POD含量继续减少，且与其他两种浓度有显著的差异，说明在Na2CO3和NaHCO3盐胁迫后CO32-和HCO3-积累所带来的毒害作用要大于其他两种盐胁迫，导致直立型扁蓿豆幼苗的抗氧化系统受损严重。

5 结论

5.1直立型扁蓿豆在NaCl胁迫时，其半致死浓度为200mmol/L；在三种盐胁迫时生长均受到抑制，其中Na2CO3+NaHCO3复盐胁迫时受到的抑制程度大于NaCl、NaCl+Na2SO4处理。