郑州市郊规模化奶牛场十二指肠贾第虫集聚体的鉴定

王海燕，贾卫军，张春辉，张卫宪，向瑞平

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046；2.河南省非常规饲料资源利用重点实验室，河南 郑州 450046)

十二指肠贾第虫(G.duodenalis)是重要的人兽共患肠道寄生虫，其包囊广泛存在于动物粪便和环境中，常通过粪便造成传播和感染，家畜是人类感染十二指肠贾第虫的主要传染源[1]。宿主感染十二指肠贾第虫后，因宿主免疫状态不同而出现不同的临床症状，免疫功能低下者多表现为腹泻、呕吐、腹痛等症状，严重时死亡，而免疫功能正常者常呈隐性感染，不表现出临床症状[2]。十二指肠贾第虫分为8个(A～H)集聚体，其中集聚体A和B是主要的人兽共患集聚体，集聚体C～H具有宿主特异性，集聚体C和D主要感染犬科动物，集聚体E、集聚体F、集聚体G和集聚体H分别主要感染偶蹄动物、猫科动物、啮齿类动物和海豹[3]。

奶牛是十二指肠贾第虫的重要保虫宿主。感染奶牛的十二指肠贾第虫集聚体主要有集聚体A、B和E，以集聚体E为优势感染集聚体[4-8]，但在我国青海省牦牛体内发现集聚体B为优势感染集聚体[9]。为了解郑州市郊规模化奶牛场十二指肠贾第虫的感染情况和集聚体分布情况，本研究对郑州市郊两个规模化场奶牛十二指肠贾第虫集聚体进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 样本采集

于2016年1月至6月，以郑州市郊区两个规模化场0-6月龄奶牛为对象，经直肠采集粪便样本363份(养殖场A，190份；养殖场B，173份)，每份30～50 g，分别装入洁净的自封袋中，标记牛号、年龄、健康状况等信息，带回实验室，置4 ℃冰箱保存备用。

1.2 DNA提取

使用E.Z.N.A.® Stool DNA Kit试剂盒(OMEGA生物技术公司，D4015-02)提取奶牛粪便的全基因组，提取的DNA于-20 ℃冻存。

1.3 PCR扩增

采用PCR对所有奶牛粪便DNA样本进行小亚单位rRNA(SSUrRNA)、磷酸丙糖异构酶 (TPI)、谷氨酸脱氢酶 (GDH) 和β-贾第素(BG)基因的扩增，引物序列、反应条件和目的片段见表1。引物委托上海生工生物工程股份有限公司合成。

表1 十二指肠贾第虫4种基因扩增的引物

SSUrRNA基因位点反应体系：1 μL DNA (第2轮模板为第1轮PCR产物)，0.3 μL上游引物(20 μmol/L)，0.3 μL下游引物(20 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.15 μL rTaq 酶(5 U/μL)，二甲基亚砜(DMSO)1.25 μL，加超纯水至25 μL。TPI和GDH基因位点反应体系：1 μL DNA，0.3 μL上游引物(20 μmol/L)，0.3 μL下游引物(20 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.15 μL rTaq 酶(5 U/μL)，加超纯水至25 μL。BG基因位点反应体系：1 μL DNA，0.3 μL上游引物(20 μmol/L)，0.3 μL下游引物(20 μmol/L)，2 μL dNTPs (2.5 mmol/L)，2.5 μL 10 × Taq buffer，0.15 μL rTaq 酶(5 U/μL)，加超纯水至25 μL。反应结束后，取5 μL PCR产物，与1.5 μL 6×Loading Buffer混合均匀，加入1%琼脂糖凝胶加样孔，进行电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统内观察。选用TaKaRa公司生产的DL 2000 Marker作为参照。

1.4 序列测定和比对

委托北京诺赛公司将PCR扩增出的目的片段进行双向测序。测序仪型号为ABI3730XL，测序试剂盒为Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, USA)。所获序列在GenBank上用Blast进行同源序列搜索，应用Clustal X 2.3.3软件进行比对分析。

1.5 种系发育分析

利用Mega 7.01软件构建种系进化树 (http://www.megasoftware.net)，采用邻接法，选用模型为Kimura 2-parameter，用bootstrap对进化树进行可靠性分析，1000个重复。

1.6 统计分析

采用χ2检验比较不同养殖场和不同年龄段奶牛十二指肠贾第虫感染率的差异，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果

2.1 奶牛十二指肠贾第虫的感染情况

如表2所示，在363份样品中共发现155份样品十二指肠贾第虫阳性，总感染率为42.7% (155/363)。养殖场A的感染率为44.2%(84/190)，养殖场B的感染率为41.0%(71/173)，两场间奶牛十二指肠贾第虫的感染率差异不显著(P>0.05)。

断奶前犊牛(0～60 d)(n=203)和断奶后犊牛(61～180 d)(n=160)十二指肠贾第虫的感染率分别为49.2%(100/203)和34.3%(55/160)，不同年龄段犊牛的感染率差异极显著 (P<0.01)。

表2 郑州市郊两个规模化场奶牛十二指肠贾第虫感染情况

2.2 集聚体鉴定

如表3所示，基于4个基因位点的序列分析，共鉴定出155个阳性样本，包括4种集聚体：集聚体E (n=149)、集聚体A (n=3)、集聚体B (n=1)和A/E混合集聚体(n=2)。各个年龄段和养殖场均以集聚体E为优势集聚体。养殖场A共发现4种集聚体，分别为集聚体E、集聚体A、集聚体B和A/E混合集聚体；养殖场B共发现3种集聚体，分别为集聚体E、集聚体A、和A/E混合集聚体。断奶前奶牛共发现4种集聚体，分别为集聚体E、集聚体A、集聚体B和A/E混合集聚体；断奶后奶牛共发现3种集聚体，分别为集聚体E、集聚体A和A/E混合集聚体。

表3 十二指肠贾第虫集聚体分布 个

2.3 种系发育分析

117个SSUrRNA序列共鉴定出2个集聚体：集聚体E(n=112)和集聚体A(n=5)。集聚体E与集聚体A序列分别与美国牛源分离株(序列号AY655701)和中国犬源分离株(序列号KJ027407)有100%同源性。

24个BG序列分别属于集聚体E(n=22)和集聚体A(n=2)。集聚体E形成1条序列，与中国奶牛源(序列号MF671887)分离株有100%同源性。集聚体A则与来自中国台湾牛源分离株(序列号EF061084)有100%同源性(图1A)。

利用GDH基因位点，共鉴定出2个集聚体：集聚体E(n=30)和集聚体A(n=2)。集聚体E阳性样本形成1条序列，与中国河南奶牛源分离株Sq57(序列号KF843925)有100%同源性。2份集聚体A阳性样品形成了1条序列，为AI亚集聚体，与中国奶牛源分离株Fy22(序列号KF843930)有100%同源性(图1B)。

利用TPI基因位点，共鉴定出3个集聚体：集聚体E(n=70)、集聚体A(n=2)和集聚体B(n=1)。集聚体E共形成2条不同的序列(E1-E2)，分别与中国奶牛源分离株(序列号KY769101和KY769102)有100%的同源性，其中E1序列为优势集聚体(n=58)。2份集聚体A样品共形成了1条序列，属于AI亚集聚体，与秘鲁羊驼源分离株 (序列号JX845464) 有100%同源性。集聚体B与中国兔源分离株(序列号HQ397719)有100%同源性(图1C)。

图1 基于BG、GDH和TPI基因邻接法构建的奶牛十二指肠贾第虫的种系发育进化树

3 讨论

十二指肠贾第虫病是人兽共患水源性疾病，目前被列为危害人类健康的10 种主要寄生虫病之一[14]，同时，家畜、伴侣动物和野生动物也是十二指肠贾第虫的常见宿主。近年来发现，奶牛感染十二指肠贾第虫普遍，呈世界性分布，在比利时、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和葡萄牙等地区均有奶牛感染的报告[1]。2007年肖淑敏首次从广东某牛场分离出十二指肠贾第虫[15]。目前，我国关于奶牛贾第虫感染情况的报道较多，包括黑龙江(5.2%)[16]、河南(3.4%)[17]、广东(2.2%和74.2%)[6, 7]、宁夏(2.12%)[5]、陕西(18.87%)[18]、青海(10%)[19]、北京(1.7%)[20]、新疆(13.42%)[21]和四川(9.4%)[8]等地区。本次调查结果显示，河南省郑州市郊区两个规模化奶牛场十二指肠贾第虫总体感染率为 42.7%，高于中国大多数地区，但低于上海(60.1%)和广东地区(74.2%)[4, 6]。

不同年龄段奶牛十二指肠贾第虫的感染率存在着较大的差异。本研究显示断奶前犊牛的感染率明显高于断奶后犊牛，此结果与Santin等的报道一致，Santin等的报道显示，1周龄至24个月龄的奶牛均可感染十二指肠贾第虫，而4～8周龄犊牛的感染率较高[22]。Mark-Carew等[23]也报道31～60日龄犊牛的感染率较高。但是Huetink等[24]却发现0～1月龄犊牛的感染率较低，而4～5月龄奶牛的贾第虫感染率最高。O'Handley等[25]报道2～3月龄奶牛的贾第虫感染率最高。

经序列比对及构建进化树分析，本研究检测出四种集聚体，包括集聚体E、A、B和A/E混合型，其中集聚体E是优势感染集聚体，此结果与中国、比利时、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和葡萄牙等地区的报告一致[1]。十二指肠贾第虫集聚体A和B 具有广泛的宿主范围，属于人兽共患集聚体。集聚体E一直以来被认为是偶蹄家畜的专属集聚体，但是，近年来，在人、非人灵长类、马和兔等的粪便样品中发现集聚体E[26,27]，同时，Lebbad 等[28]发现集聚体E 形成了集聚体A的一个小分支，上述研究提示集聚体E可能是重要的人兽共患集聚体。本研究结果表明，郑州市郊大型规模化奶牛场奶牛十二指肠贾第虫的感染率较高，存在人兽共患风险，需引起重视。