三角梅炭疽病病原分离与鉴定研究报告

张胜男

摘   要：为明确三角梅炭疽病的具体致病菌，采用形态学鉴定法对三角梅感病组织部位进行切片和组织分离，以离体叶片接种法验证病原菌的致病性。通过切片法对病原菌分生孢子器及分生孢子形态进行鉴定;通过组织分离法对致病菌的菌落形态及分生孢子等生长形态进行观察鉴定，确定了该致病菌为炭疽菌属胶孢炭疽菌，从而为有效防控该病害提供理论依据。

关键词：三角梅;炭疽病;胶孢炭疽菌;分离;鉴定

文章编号： 1005-2690（2020）16-0010-02       中图分类号： S435.675       文献标志码： B

三角梅是紫茉莉科叶子花属木质藤本状灌木，原产于南美洲巴西。苞片有红、黄、紫、白等多种颜色，其五彩缤纷的表现特征契合我国多个民族的文化，因此广受人们的喜爱[1]。三角梅又称叶子花，近10年来，三角梅陆续被海南和全国各地的几十个城市选定为省花、市花[2]。三角梅具有很高的观赏价值，但炭疽病的发生却在一定程度上影响其正常生长和美观程度。较为常见的病害有三角梅炭疽病、叶斑病和枯梢病等[3]。当前，对于三角梅炭疽病的报道仅停留在症状描述的层面，没有清晰系统的症状、病原图片，存在病原归属不准确等问题。本研究将系统描述三角梅炭疽病病原的分离与鉴定，从而为该病害的诊断和防治提供理论依据[4]。

1   材料与方法

1.1   试验材料

病原菌分離和接种均采用种植于福建农林大学的紫色三角梅叶片。病原菌分离采用马铃薯琼脂培养基（PDA），抗生素选用氨苄青霉素（Ampicillin）。

1.2   试验方法

1.2.1   病组织切片法

摘取感病叶片，将叶片感病部位切成细叶丝，置于显微镜下观察。

1.2.2   病组织分离法

1.2.2.1  病原菌分离纯化

摘取数片感病叶片，在超净台内进行无菌操作，切下感病部位与健康部位交界处，约为5 mm×5 mm。将小叶块浸入70%酒精中5 s、5%次氯酸钠浸泡60 s，用灭菌水漂洗3遍，晾干后将小叶块转移至含氨苄青霉素的PDA培养基上，每个培养基上放3个呈等边三角形的小叶块，均匀放在7 cm培养皿内，制作5皿。25 ℃培养箱培养，分离出多个单菌株。

1.2.2.2  病原菌致病性测定

每个单菌株都进行以下的平行试验：选取3片形态大小、生长状况尽量一致的健康叶片，其中2片叶用作病原菌接种，1片叶用作空白对照叶片。将叶片用无菌水冲洗干净后再用70%乙醇擦拭一遍。用作接种的其中1片叶片用已灭菌的接种针在健康的叶片上于左上处和右下处2个接种点各针刺5下。从已分离到单株致病菌的培养基上切取菌丝块（5 mm×5 mm），将生长菌丝的一面放在刺伤的叶片伤口处，置于垫有浸湿滤纸的培养基内保湿培养。另1片叶用从培养皿上洗脱收集的孢子悬浮液，浓度调至（1.0～2.0）×105个/mL后，均匀地喷洒在叶片上保湿培养。空白对照叶片放在另一个垫有浸湿滤纸的培养基内保湿培养。于25 ℃培养箱内培养，定期观察菌落并详细记录叶片的发病情况，非致炭疽病的菌株不发病或者表现出与初始病叶不同的病状。选取和初始病状一致的发病叶片对发病叶片继续进行分离培养。

1.2.2.3  病原菌形态学观察

将致病菌株置于PDA培养基上，于25 ℃条件下培育，定期观察菌落并记录菌落的形态特征和生长状况，挑取菌丝体及分生孢子在显微镜下观察其形态。

2   结果与分析

2.1   病害症状

病害主要发生在叶片上，病斑常常从叶尖或者叶缘开始发生，初期呈现圆形黑色斑点，在斑点周围会有黄色晕圈，紧接着会扩大成圆形或不规则形的病斑;继续扩大后病斑会变干枯灰褐色，枯斑上会着生一轮一轮的同心状小黑点，叶片上下都有着生;后期病斑会连成片，导致叶片无法生长而脱落（图1）。

2.2   病组织切片鉴定

将感病处小黑点切开发现，小黑点为病原菌的分生孢子盘，盘内密生分生孢子梗，无色，梗上顶生分生孢子1个。分生孢子两端稍尖，直形或稍弯曲，单孢，无色（图2）。符合胶孢炭疽菌的切片形态特征。

2.3   致病性测定

病菌分离培养得到3个培养性状不同的菌株，分别对三角梅健康叶片进行接种，只有1个菌株接种后发病，其余2个均未发病。这里认为分离到的未使三角梅叶片发病的菌株可能为其他地方的病菌飘散至三角梅叶片上，并非导致三角梅炭疽病的病原。目标菌株的孢子悬浮液接种的叶片7 d后开始发病，菌块接种的叶片和空白对照未出现发病症状。菌块接种未能发病者，其原因可能为：孢子量较少、发病太慢或者未达到发病的初始菌量，也可能为接种菌块的叶片抵抗病菌侵染的能力较强。孢子悬浮液致病的叶片7 d后叶缘处变枯黄，最终整片叶变灰褐色且叶缘处有小黑点的产生。从接种后的发病叶片上继续分离病原物，再次获得了病原菌的菌体形态和分生孢子形态，与最初分离物各项形态一致。再次回接至健康叶片后，叶片发病状况与原始病叶一致。确定分离到的该菌为致病菌。

2.4   形态学鉴定

采用PDA培养基于25 ℃培养箱内培养，培养3 d后菌落直径2 cm左右，菌落边缘整齐，气生菌丝疏松，呈白色。培养5 d菌体中央变成淡黄色，后期逐渐变成橘红色（图3）。待气生菌丝布满培养皿时，中央菌丝体变为灰绿色，且有表面油状灰绿色堆状物的出现。挑取堆状物发现为分生孢子聚集而成，分生孢子呈椭圆形，单孢，无色，内含2个油球（图4）。符合胶孢炭疽菌的培养形态特征。

3   结论与讨论

炭疽病是植物中常见的病害，寄主非常广泛，在一些农作物及果树上容易发生，炭疽病的发生会严重影响产量，若发生在观赏植物上，则会降低其观赏价值[4]。由于炭疽病菌是一种弱寄生菌，在植株健壮时并不容易侵染，加强栽培管理就是对植株进行防护最重要的手段。三角梅喜温暖湿润气候，栽培方式多样，盆栽式三角梅较易进行防护管理。对于大规模露天栽培的三角梅来说，连续的潮湿阴雨天容易发生炭疽病菌，在病害的侵染初期可以喷洒预防性药剂，例如代锌锰森、吡唑醚菌酯等。本研究明确了三角梅炭疽病的病原菌，有助于为该病害制定更有效、更具针对性的防治策略。

参考文献：

[ 1 ] 徐夙侠，王亮生，舒庆艳，等.三角梅属植物的生物学研究进展[J].植物学通报，2008（4）：483-490.

[ 2 ] 吴淑梅.三角梅的养护技术及应用初探[J].厦门科技，2002（4）：60-62.

[ 3 ] 陈楚戟.盆栽三角梅养护管理[J].中国花卉园艺，2015（14）：42-43.

[ 4 ] 韩长志.胶孢炭疽病菌的研究进展[J].华北农学报，2012，27（S1）：386-389.