基于SSR的羊捻转血矛线虫病的分子鉴定及PCR检测方法的建立

（铜仁学院，贵州 铜仁 554300）

羊捻转血矛线虫（Haemonchus contortus）属圆线目、毛圆科、血矛属线虫，是一种呈世界性分布的寄生虫。羊捻转血矛线虫病由寄生在羊皱胃当中的捻转血矛线虫通过刺穿皱胃黏膜吸食血液引起。该病主要表现为贫血、消瘦等症状，有研究表明，100条成虫每天可吸取约1.5 ml血液，羊严重感染时周围内成虫可达上千条[1]。如养殖场管理不规范、环境控制不当，很容易导致捻转血矛线虫病的大规模爆发，造成巨大的经济损失。目前，捻转血矛线虫病的诊断主要依靠显微镜下观察和辨认粪便当中的虫卵来进行确诊，不但耗时费力，还需要有一定的虫卵识别经验，准确度较差。微卫星DAN分子标记（SSR）又称简单串联重复序列，由1～6个核苷酸组成的重复单位构成，序列片段多集中在100～300 bp之间。微卫星DNA分子标记特异性高、操作简单，且对DNA质量要求不高，对降解较严重的DNA也能扩增出质量较高的条带，在临床上具有更高的应用价值，被广泛应用在遗传多样性分析、遗传图谱构建、动植物品种鉴定[2]等方面。

林海等利用ITS序列对林麝粪样中的疑似血矛属线虫虫卵进行鉴定，通过BLAST比对和系统发育分析鉴定出其均为捻转血矛线虫[3]。罗琴等同样基于ITS序列对野生动物粪便中毛圆线虫虫卵进行分子鉴定并建立了特异性PCR检测方法[4]，陈武等[5]对长颈鹿捻转血矛线虫成虫ITS序列进行测定并进行BLAST比对鉴定。以上均利用ITS序列在GENEBANK数据库中进行比对达到捻转血矛线虫或虫卵鉴定的目的，因此实际应用价值不高。利用微卫星进行物种鉴定在许多家畜及鱼类上已有较广泛的应用，但捻转血矛线虫的鉴定鲜有报道。本试验筛选出两组可靠的微卫星引物用以对捻转血矛线虫的分子鉴定，为后期虫卵鉴定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

羊捻转血矛线虫采自屠宰的贵州白山羊皱胃当中，PBS反复冲洗虫体以去除皱胃污染物，用0.9 %生理盐水保存。血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司），2×PCR Mix（Takara，Premix Taq™（TaKaRa Taq™Version 2.0）），2×PCR Mix（Promega，GoTaq®Master Mixes），1.1×PCR Mix（北京擎科生物技术有限公司，1.1×T3 Super PCR Mix），DNA Marker（Takara，50 bp DNA Ladder （Dye Plus）），捻转血矛线虫微卫星引物来自殷方媛文献[6]，引物由武汉天一辉远生物科技有限公司合成，引物信息见表1。

表1 微卫星引物信息

1.2 方法

将采集的若干条捻转血矛线虫成虫混合放入1.5 ml离心管中，并用剪刀剪碎成末状，按基因组DNA提取试剂盒说明书进行提取。通过梯度PCR筛选引物并进行组合，优化二重PCR体系和条件，最终确定两组可用于鉴定捻转血矛线虫的PCR体系。PCR反应体系为PCR Mix 5 μl，上下游引物各0.4 μl，DNA 0.5 μl，dd H2O 3.7 μl，总体积10 μl；PCR程序为95℃ 5 min，95℃ 30 S，退火温度为梯度30 S，72℃ 30 S，72℃ 5 min，4℃保存。循环次数30次。3%琼脂糖上样。

2 结果

2.1 单重PCR体系的优化

试验设计5个退火温度（62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃），分别用3对引物（Hcms 15、Hcms 36和Hcms 37）进行梯度PCR扩增。结果表明，Hcms 15引物和Hcms 37最佳退火温度为62～58℃，Hcms 36引物在62～50℃范围内均可扩增出较好的条带。但引物Hcms 37出现非特异性扩增（大小在200～250 bp之间）。总体结果显示，PCR条带清晰，片段大小在预期范围内（见图1）。

图1 捻转血矛线虫成虫微卫星序列单重PCR扩增产物

M为DNA Marker ，1～5为引物Hcms 15，6～10为引物Hcms 36，11～15为引物Hcms 37。每组引物退火温度依次为62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃。

2.2 二重PCR体系的优化

试验选取5个退火温度（62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃），分别用3对引物进行两两组合，对组合引物Hcms 15和Hcms 36、Hcms 15和Hcms 37、Hcms 36和Hcms 37进行梯度PCR扩增。结果表明，三个引物组合均扩增出预期条带，Hcms 36和Hcms 37组合由于片段大小相近，因此重合在一起不能分开。Hcms 15和Hcms 37组合由于受Hcms 37的非特异性扩增的影响，仍有一条200～250 bp范围的不清晰条带（见图2）。

图2 捻转血矛线虫成虫微卫星序列二重PCR扩增产物

M为DNA Marker ，1～5为引物Hcms 15和Hcms 36的组合，6～10为引物Hcms 15和Hcms 37的组合，11～15为引物Hcms 36和Hcms 37。每组引物退火温度依次为62.0 ℃、60.0 ℃、58.0 ℃、55.0 ℃和50.0 ℃。

2.3 特异性检测

对引物Hcms 15、Hcms36、Hcms 37及两种组合进行PCR扩增（退火温度为62℃）。结果显示，所有条带均在预期片段大小范围内，单重PCR和二重PCR结果一致，符合预期结果。引物Hcms 15出现两条亮度不一的条带，但都在266～289 bp预期的范围内，符合微卫星标记的特点（见图3）。

图3 捻转血矛线虫成虫微卫星序列PCR扩增产物特异性检测

M为DNA Marker ，1～3为引物Hcms 15、Hcms 36和二者的组合，4～6为引物Hcms 15、Hcms 37和二者的组合，退火温度均为62℃。

2.4 灵敏性检测

依据优化条件，对DNA样品（浓度为400 ng/ μl）进行20倍梯度稀释。用Hcms 15和Hcms 36组合进行PCR扩增，结果表明，二重PCR条带在8号胶孔处仍可分辨出来，因此将最低检测浓度定为2 ng/ μl（见图4）。

图4 PCR灵敏度试验

M为DNA Marker。1～12号DNA浓度依次为：400 ng/μl、20 ng/μl、10 ng/μl、6.7 ng/μl、5 ng/μl、4 ng/μl、3 ng/μl、2.7 ng/μl 、2 ng/μl、1.3 ng/μl、1 ng/μL和0.8 ng/μl。

2.5 重复性检测

用3个公司生产的3种PCR Mix对Hcms 15和Hcms 36、Hcms 15和Hcms37两种组合进行PCR扩增，结果表明，3种PCR Mix均能稳定扩增出目的条带（见图5）。

图5 PCR重复性试验

M为DNA Marker。1～3号引物Hcms 15、Hcms 36的组合，4～6为引物Hcms 15、Hcms 37的组合，退火温度均为62℃。

3 讨论

微卫星分子标记能很好地反映生物个体或种群间某种差异特征的DNA片段，是一种基于DNA片段长度多态性的分子标记技术。目前，在作物上应用微卫星标记进行品种鉴定的较多[7，8]，也有在宠物犬中利用微卫星进行品种鉴定[9]，但动物中应用最多的仍是线粒体DNA片段或ITS序列等其他分子标记。

单重和二重PCR在较大的温度范围内均能扩增出来产物，引物Hcms 37有非特异性扩增，在提高退火温度的同时，非特异性扩增有所降低，不影响目的条带的扩增，且非特异性扩增条带的亮度远低于目的条带，因此可作为标记鉴定捻转血矛线虫。引物Hcms 15在片段大小范围内出现了两条条带，符合微卫星标记的特征，即微卫星标记是根据其两侧已知的保守序列进行引物设计，扩增产物包含微卫星标记序列在内的片段，片段大小反映的是不同微卫星标记重复次数导致的多态性，为共显性标记[10]。因此，同一个体捻转血矛线虫也可出现两条长度不同的片段，而本试验所用到的DNA为捻转血矛线虫的混合DAN。

灵敏性检测试验表明，二重PCR可扩增出浓度为2 ng/μl的DNA样品。罗琴[4]等利用ITS区序列对捻转血矛线虫DNA灵敏性检测低至25.5×10-9ng/μl，远高于微卫星的灵敏度。这可能与两种分子标记在虫体内的拷贝数量有关。

4 结论

综上所述，本试验建立的二重PCR检测方法能有效避免捻转血矛线虫在粪便虫卵检查法中假阳性的出现，有一定的临床实用价值。