铜绿假单胞菌M19降解黄曲霉毒素B1的产物研究

王佳兴，谢岩黎✉，宋娟娟，马卫宾，孙淑敏，李 倩

（河南工业大学粮油食品学院，河南省粮油食品安全检测与控制重点实验室，河南 郑州 450001）

黄曲霉毒素污染是粮食安全面对的巨大挑战之一，其广泛存在于花生、玉米和高粱等农作物中。其中 AFB1具有极强的毒性，致癌性和致突变性，对人类健康造成严重威胁[1]。微生物降解AFB1以其反应条件温和、成本低等优点已被广泛研究，对于降解产物研究的缺乏成为了限制其走向应用的主要障碍。目前，已经发现的降解产物有十几种，其中，有命名的分别是黄曲霉毒醇、AFB2a、AFD1、AFD2、AFD3、邻苯二甲酸酐、8,9不饱和碳的 AFB1、AFB1-8,9-二氢二醇。AFB2a作为微生物降解AFB1的降解产物早在1972年就已被发现。有学者针对 AFB1的降解途径以及降解产物进行了研究，Samuel等[2]的研究表明，孵育24 h后恶臭假单胞菌将AFB1降解至不可检测水平。利用气相色谱质谱（GC-MS）和傅立叶变换红外光谱（FT-IR）分析发现，AFB1降解并转化为 AFD1，AFD2和 AFD3（推测是通过内酯和呋喃环的羰基部分的损失）。在另外一项研究中，WU[3]利用红外光谱（IR）表征了导致黄曲霉毒素（AF）完全降解的是一种酶，其负责打开 AFB1的呋喃环，导致随后的水解。Taylor等[4]鉴定并表征了耻垢分枝杆菌的 F420H2依赖性还原酶，该酶催化 AF降解。这些酶不同于早先报道降解AF的酶，其通过还原α,β-不饱和酯，导致内酯环不稳定，从而达到解毒的作用。Wang等[5]从PhanerochaetesordidaYK-624中纯化的锰过氧化物酶（MnP）在48 h后能够降解86%的AFB1。随后的分析表明，AFB1首先被MnP氧化为AFB1-8,9-环氧化物，然后水解为 AFB1-8,9-二氢二醇，在随后的水解步骤中打开呋喃环，且检测结果显示降解产物诱变活性降低。Wang等[6]的研究发现，经过诱导的地衣芽孢杆菌（BL010）的粗酶液可以有效降解 AFB1（降解率达到 97.3%），利用四极杆飞行时间液相色谱-质谱（LC-Q-TOF/MS）检测到分子式为C12H14O4的降解产物。Eshelli等[7]通过液相色谱-质谱（LC-MS）和FT-IR对红曲霉菌株（ATTC 4277）降解AFB1的反应途径进行了全面分析。假设 AFB1通过一系列反应被降解以形成具有分子式C13H16O4和质量为236.104 9的芳族化合物，并对降解过程进行了有力推断。

在最新的Li[8-9]的两篇报道中，总共发现了八种降解产物，m/z 207.0（C11H10O4）比AFB1分子少了C6H2O2，是由于AFB1的酯键破坏，加氢形成乙醚键；AFB1的内酯环断裂，失去甲基和两个一氧化碳，产生代谢物m/z 243.06（C14H10O4），再由羟基损失和双键断裂继而形成 m/z 229.09（C14H12O3），随后打开苯环失去一氧化碳，醚键断裂形成 m/z 201.09（C13H12O2）；C14H12O3经过醚键断裂脱氧，以及苯环加成反应形成产物 m/z 221.15(C14H20O2)；m/z 361.09（C18H16O8）比AFB1分子多CH4O2，由呋喃环左侧的羟基和甲氧基的加成反应形成，继而酯键断裂及羟基和甲氧基的断裂，苯环上的加成反应形成 m/z 277.14（C16H20O4），m/z 221.15（C14H20O2）比 C16H20O4少一个C2O2分子，是由于酮基和甲氧基的断裂。

通过质谱检测，未检测到任何降解产物的报道也有很多（Alberts等[10-11]，Farzaneh 等[12]，Sangare等[13]，RakshaRao等[14]）。同样，Xia等[15]分离得到具有AFB1降解能力的枯草芽孢杆菌，AFB1降解后利用质谱未检测到任何降解产物，他们推测降解反应可能是多种酶在共同发挥作用，将AFB1降解为不同于本身性质的物质。基于实验室筛选保藏的 AFB1降解菌 M19产生的 AFB1降解酶PADE，本课题组已对降解产物的致突变性和细胞毒性进行了研究，结果显示，AFB1降解后致突变性和细胞毒性均明显降低。本研究进一步对AFB1降解液进行薄层色谱及荧光光谱分析，分析降解产物可能的结构变化，通过液质检测 AFB1降解产物。对于降解产物的研究为细菌M19和降解酶PADE降解AFB1在食品工业及饲料产业中的应用提供理论依据和实践基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

WD-9403C薄层色谱扫描仪：北京六一仪器厂；F-7100荧光分光光度计：日本株式会社日立高新技术科学那珂事业所；实验所用氯仿、丙酮（分析纯）等试剂：洛阳昊华化学试剂有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 薄层色谱（TLC）检测降解产物

测试样品：AFB1标准溶液（2.5 μg/mL）；降解反应进行后，通过萃取分层分别获得有机相及水相，有机相通过氮气吹干重新溶解在展开剂里，水相通过超滤去除酶蛋白，即可点样进行薄层色谱分离，同时以甲醇代替 AFB1经同样处理作为对照。

按照实验样品大小将硅胶板裁成合适尺寸，设置好点样的位置，取样品10 μL点在硅胶板相应的位置上，将点好样品的溶剂吹干，硅胶板斜放于展开剂（氯仿：丙酮=85∶55）[16]中，展开剂浸没薄层板7～8 mm，待展开剂前沿上升到硅胶板的另一边缘将板小心取出。将晾干的薄层板置于365 nm紫外灯下观察，记录荧光斑点的位置。

1.2.2 降解产物的荧光光谱分析

将 25 μL的 AFB1与 975 μL的PADE溶液混合进行降解反应，用二氯甲烷萃取有机相在氮气下吹干，重新溶解在甲醇水溶液中（甲醇：水=1∶1），在荧光分光计下，设置激发波长365 nm，扫描发射光谱[17-18]，AFB1与磷酸盐缓冲液混合作为对照组。

1.2.3 液质检测降解产物

将 25 μL的AFB1与 975 μL的PADE溶液混合进行降解反应，分别在降解0、1、3 d时终止反应，萃取有机相，用液质联用仪检测。液质采用Thermo Q Exactive Plus LCMS系统，ACQUITY UPLC HSS T3 色谱柱（2.1×100 mm，1.8 μm）。

1.3 数据处理

利用Origin 2018专业软件绘图，对产物荧光特性的减弱进行表征，方差分析的显著性水平是P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 薄层色谱检测分析

TLC薄层色谱扫描图显示（图1），经过降解后，AFB1的荧光特性减弱（仍有部分毒素残留），RakshaRao等[14]也发表了相似的结论，有机相降解液未检测到新的荧光吸收物质，水相降解液也未检测到吸收物质，表明降解产物没有荧光吸收。

图1 降解AFB1的TLC分析Fig.1 TLC analysis of degradation of AFB1

2.2 降解产物的荧光光谱分析

AFB1经PADE降解后（图2），产物的荧光特性减弱（仍有部分 AFB1未降解）。AF的荧光特性与其结构中的内酯环有关，内酯环断裂会导致荧光消失[19]，则可推测此降解反应是 AFB1的内酯环裂解。而筛选铜绿假单胞菌 M19是采用香豆素为碳源的培养基筛选而来，内酯环是香豆素结构的一部分，进一步证实了 PADE对 AFB1的作用位点是内酯环。相同的结论有Samuel等[2]，Motomura 等[20]，Guan 等[21]，徐丹[17]，蔡国林等[18]的研究。图中实验组的荧光光谱较对照组向右（低能量方向）移动，可能是用激发波长激发发射光谱，发射光谱的最高峰有能量损失，或物质结构改变分子重排消耗了能量，发射光谱的峰向长波长方向移动。

图2 PADE对AFB1荧光特性的影响Fig.2 Effect of PADE on the fluorescence characteristics of AFB1

2.3 液质联用检测AFB1降解产物

根据 AFB1降解后的 LC-MS图谱分析以及AFB1降解产物的相关文献，发现在降解的过程中，在保留时间7.85 min附近，出现一质荷比为227.18的物质P，其峰面积逐渐增大（表1），可视为降解产物；AFB1的保留时间为 10.01，随着降解时间的增加，其峰面积逐渐降低，含量逐渐减少（表1）。根据物质P的一级质谱图（图3），利用Xcalibur软件分析其分子式为C14H10O3。与Li[8]报道的降解产物 C14H12O3相比少了两个氢原子，我们推测，可能在反应过程中只发生了羟基损失但双键并未断裂。AFB1经过降解酶PADE作用后，其内酯环断裂，失去甲基和两个一氧化碳，并发生羟基损失（图4）。这符合我们之前的判断，此降解反应是 AFB1的内酯环裂解，但此结果需要进一步验证。本研究中并未得到任何中间产物，分析原因，可能由于时间点选取的单一性，导致我们并未观察到降解过程中的其他中间产物。在进一步的实验中，我们期望通过观察多个不同降解时间点的产物组成，并通过质谱来探索具体且详尽的AFB1降解机制。

表1 降解过程中峰面积的变化Table 1 Change of peak area during degradation

图3 物质P的质谱图Fig.3 Mass spectrum of substance P

图4 推断的AFB1可能降解途径Fig.4 Proposed scheme of AFB1 degradation

3 结论

通过对 AFB1降解液进行薄层色谱和荧光光谱分析，发现降解后荧光减弱，表明了 AFB1降解过程中内酯键的断裂；结合薄层色谱和荧光光谱分析，液质检测发现一分子量为226的降解产物，利用Xcalibur软件分析其分子式为C14H10O3，并对其降解途径进行推测，AFB1经过降解酶PADE作用后，其内酯环断裂，失去甲基和两个一氧化碳，并发生羟基损失。

在前期的工作中，本课题组已对于降解产物的致突变性和细胞毒性进行了研究，结果显示，AFB1降解后致突变性和细胞毒性均明显降低。本研究已对 AFB1降解产物和降解途径进行了初步的阐释。这为AFB1降解菌M19和降解酶PADE降解 AFB1在食品工业及饲料产业中的应用提供理论依据和实践基础。在进一步的实验中，我们期望通过观察多个不同降解时间点的产物组成，并通过质谱来探索具体且详尽的AFB1降解机制。

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