I类新药YHR46化学残留分析方法的建立

赖品甜 曹穗娴(扬子江药业集团广州海瑞药业有限公司，广东 广州 510663)

0 引言

YHR46是自主创新的I类化学新药。糖尿病动物模型研究发现，YHR46疗效显著，能够明显降低血糖水平、有效保护肾脏组织和胰岛β细胞。本文采用高效液相色谱法建立了建立YHR46化学残留检测方法。

1 试药与仪器

1.1 试药

YHR46对照品：来源于上海美迪西生物医药股份有限公司，磷酸氢二钠、乙腈(色谱级)、异丙醇、纯化水。

1.2 仪器

高效液相色谱仪型号为Agilent1260，电子天平为梅特勒XS205。

2 擦拭方法摸索

2.1 化学残留限度及擦拭面积确定

根据《YHR46清洁验证前期评估表》，YHR46活性成分-YHR46残留限度为2.91μg/cm2，根据确定的相应设备取样位置可知，擦拭面积约为25cm2，提取体积拟定为5mL，因此化学残留限度浓度为14.55μg/mL(残留限度×擦拭面积/提取体积)。

2.2 擦拭材质及工具确定

根据《YHR46清洁验证前期评估表》，本次清洁验证设计的设备材质分别为不锈钢和陶瓷，而不锈钢为大部分设备的材质，因此采用不锈钢进行擦拭方法摸索，后对陶瓷材质进行擦拭回收率的确认，最后对不锈钢和陶瓷两种材质进行系统的方法学验证。

擦拭工具：进行擦拭取样时，选择的擦拭工具为无纺布净化棉签。无纺布净化棉签能耐受一般有机溶剂的溶解，并且不会脱落纤维，故在使用前用清洁溶剂浸润即可。

2.3 溶剂的筛选

稀释剂A：分别量取水500mL和异丙醇500mL，混匀，即得水-异丙醇(50:50)。

稀释剂B：分别量取水800mL和乙腈200mL，混匀，即得水-乙腈(80:20)。

对照品溶液：精密称取YHR46对照品14.5mg，置100mL棕色量瓶中，加入稀释剂使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备溶液SST，再精密量取1mL置于10mL棕色量瓶中，加稀释剂至刻度，摇匀，即为对照品溶液(14.5μg/mL)。

对稀释剂A和稀释剂B，以及对应稀释剂配制的对照品溶液进行进样，结果中稀释剂A和稀释剂B空白图谱无干扰峰，基线平稳，用稀释剂A和稀释剂B配制的对照品溶液理论塔板数均大于2000，拖尾因子分别为1.07和1.12，因此选择稀释剂A：水-异丙醇(50:50)作为稀释剂。

2.4 过滤滤头的吸附影响考察

选取用稀释剂A所配制的对照品溶液，精密量取5mL于注射器中，用聚四氟乙烯滤头进行过滤，弃去1mL、2mL、3mL，取续滤液进样，过滤样品的主峰峰面积与未过滤的峰面积进行对比，比值应在0.98～1.02之间，结果如表1所示。根据表1的数据，以各过滤样品的主峰峰面积与未过滤的峰面积进行对比，比值均在0.98～1.02，无明显差异，选取弃去溶液体积2mL。

2.5 提取溶剂的确定

精密量取对照品储备溶液(两份)分别滴加在两根干燥的无纺布棉签上，自然晾干或使用电吹风温和吹干，剪断擦拭棉签头，将同一份滴加溶液的棉签头放入同一个取样瓶中，共两个瓶，精密加入提取溶剂(分别是稀释剂A和稀释剂B)5mL，加盖，5℃下超声20min，过滤，取滤液测定。各提取溶剂的回收率应不低于50%，检测结果如表2所示。由表2可知，稀释剂A和稀释剂B作为提取溶剂，回收率分别为89%和88%，因此选择稀释剂A作为提取溶剂。

表1 三种弃去溶液体积对比结果

表2 两种稀释剂检测结果

2.6 超声时间的确定

以稀释剂A作为提取溶剂配制对照品贮备液，分别考察5℃下超声10min、15min、20min后，过滤，取续滤液测定。样品的提取回收率应不低于50%，选取回收率较大的超声时间作为最终的超声时间检测结果如表3所示。

由表3可知，5℃下超声10min、15min、20min回收率分别为88%、88%、89%，考察5℃下超声20min回收率较大，选择样品的超声时间为20min。

2.7 擦拭溶剂的确定

根据本YHR46的理化性质，其在甲醇、乙醇、乙腈和0.1mol/L HCl、0.1mol/L NaOH中易溶，在水中极易溶解，且考虑到车间的清洗情况，本次选择纯化水、乙醇作为筛选的擦拭溶剂，在上述选定的稀释剂、提取溶剂、超声时间、过滤体积的基础上，对不锈钢板进行擦拭操作。擦拭回收率应不低于50%，两种擦拭溶剂进行比较，选取回收率较高的作为擦拭溶剂，若二者无明显差异，则首选纯化水作为擦拭溶剂，检测结果如表4所示。从表4可知，擦拭溶剂为纯化水及乙醇，样品回收率分别为89%、89%，两者之间无明显差异，且均不低于50%，因此选择纯化水作为擦拭溶剂。

通过以上擦拭方法摸索，基本确定了YHR46化学残留提取方法，以稀释剂A作为溶剂及提取溶剂，用聚四氟乙烯滤头进行过滤，弃去2mL，5℃下超声20min，选择纯化水作为擦拭溶剂。

3 方法学研究

3.1 专属性试验

取溶剂空白溶液、空白擦拭样品溶液、对照溶液分别在规定色谱条件下进样，采集空白溶液、空白擦拭样品溶液、对照溶液图谱，空白溶液以及空白擦拭样品溶液无与对照品溶液中主峰(YHR46)保留时间相同或相近(保留时间±5%)的色谱峰。

3.2 系统适用性试验

取对照品溶液连续进样6次，主峰(YHR46)保留时间的RSD为0.2%(标准RSD≤2.0%)，主峰(YHR46)峰面积的RSD为0.05%(标准RSD≤5.0%)。

3.3 检测限和定量限

取对照品溶液，稀释后进样，信噪比为10:1时为定量限，信噪比为10:1时为检测限，检测限浓度为0.0068736μg/mL，定量限浓度为0.022912μg/mL。

3.4 线性范围

分别对照品储备液溶液1mL、2mL、2mL、3mL、4mL分别置20mL、25mL、20mL、25mL、20mL容量瓶中，加稀释剂至刻度，得到5个浓度样品溶液(分别相当于残留限度50%、80%、100%、120%、200%)[1]，上述各浓度样品及LOQ样品各进样1次，对本方法的线性进行考察，结果如表5所示。

表3 三种超声时间检测结果

表4 两种擦拭溶剂检测结果

表5 六种浓度样品考察结果

由试验结果可知，主成分在0.022912～28.64μg/mL范围内呈良好线性，线性方程为y=1.92191×10-5x-0.0233709，r为0.999972(标准r≥0.999)。

3.5 擦拭取样回收率

在不锈钢板以及陶瓷板上用铅笔划出5cm×5cm的区域，划出10块。每方块间隔不小于2cm，精密移取对照品储备液SST0.4mL(3份)、0.5mL(3份)、0.6mL(3份)，每份尽量均匀地涂在一个5cm×5cm的正方形上，共涂布9份。自然干燥或用电吹风温和地吹干。

用纯化水润湿擦拭棉签，剪将擦拭同一方块的棉签头放入同一个取样瓶中，共9个瓶，精密加入水-异丙醇(50:50)5mL，盖上盖子，5℃超声20min，用聚四氟乙烯滤头滤过，弃去2mL，取滤液及对照品溶液各10µL测定，记录色谱图，按外标法计算，擦拭回收率及其回收率的RSD%。不锈钢板和陶瓷板测试结果如表6和表7所示。

由试验结果可知，不锈钢板及陶瓷板的擦拭取样回收率分别为76%、78%，RSD分别为4%、3%。

3.6 溶液稳定性

取供试品溶液及对照品溶液分别于5℃条件下放置0h、4h、8h、12h、24h后，以0h为100%计算相对回收率，结果如表8所示。从表8显示，回收率均在98%～102%之间，对照品溶液、供试品溶液(陶瓷板和不锈钢板)在24h内稳定。

表6 不锈钢板测试结果

表7 陶瓷板测试结果

表8 五个不同时间测试结果

4 结语

本方法测定结果准确，专属性好；YHR46化学残留在0.022912～28.64μg/mL范围内呈良好线性，不锈钢板擦拭回收率为76%(RSD=4%)，陶瓷板擦拭回收率为78%(RSD=3%)，能有效检出YHR46化学残留的量，可以作为YHR46中化学残留检测方法。