枣飞象对枣树植物挥发物的EAG和行为反应

阎雄飞, 刘永华, 王亚文, 李 刚, 景 瑞, 杨亚洁

(榆林学院生命科学院, 陕西榆林 719000)

枣飞象Scythropusyasumatsui，别名枣食芽象甲、太谷月象、枣月象，属鞘翅目(Coleoptera)象甲科(Curculionidae)飞象属Scythropus，是枣树Zizyphusjujuba的重要害虫(师光禄等, 2000; 任登洲和齐向英, 2009)。枣飞象在我国广泛分布于山西、陕西、河北、河南、新疆、宁夏等红枣主产区，是国家林业局公布的重要危险性有害生物之一。枣飞象主要以成虫取食枣芽危害，迫使枣树二次萌芽，大量消耗寄主营养，导致结出苦涩的“二茬枣果”或者不结果，严重影响红枣品质和产量(唐学亮等, 2013; 阎雄飞等, 2019)。近年来，由于枣飞象在陕西和山西等地的枣区连年成灾，造成枣果绝收和幼树死亡的现象，严重制约区域经济和生态环境的发展(阎雄飞等, 2017)。目前使用化学农药降低虫口密度是枣区防治枣飞象的主要方法，由于长期大量使用化学农药，枣飞象已对很多农药产生抗性，探索绿色高效的枣飞象防治技术迫在眉睫。因此，利用植物挥发性物质监测和控制枣飞象具有重要实践意义。

自然界植物释放出醇类、酮类、酯类、萜烯类等挥发性有机化合物，每种植物释放挥发性有机化合物的种类和比例都不相同，各自都以较为精确的种类和比例构成化学指纹谱(戴建青等, 2010; 闫凤鸣, 2011; Knolhoff and Heckel, 2014)。在昆虫和植物互作过程中，这些化学指纹谱是昆虫和寄主相互通讯的化学信号，寄主植物释放的化学信号对昆虫的生存、发展和繁衍具有重要意义，在植食性昆虫远距离寻找寄主、补充营养、交配、产卵等生命活动中发挥着重要作用(杜永均和严福顺, 1994; 樊慧等, 2004; Bruceetal., 2005; Dicke and Baldwin, 2010)。例如；甘薯叶片挥发物柠檬烯是甘薯蚁象Cylasformicarius寄主定向的重要活性物质(贾小俭等, 2017)，云斑白条天牛Batoceralineolata寄主光皮桦和核桃挥发出的(Z)-3-己烯-1-醇是引诱该天牛前来补充营养的挥发性物质(王保新等, 2014)，棉花、番茄等作物所释放的挥发性组分不仅能刺激美洲棉铃虫Heliothiszea的产卵行为，且落卵量显著增高(Tingleetal., 1989)，胡萝卜Daucuscarota叶片所释放的桧烯水合物、4-萜品醇、乙酸冰片酯、顺-3-己酸乙酯等化合物是引诱香芹黑凤蝶Papiliopolyxenes产卵的关键性物质(Bauretal., 1993)；明确寄主和昆虫进行化学通讯的活性物质，对于未来开发植物源引诱剂具有重要实践价值。

目前对枣飞象的研究多集中在形态学特征和生物学特性(贾增波等, 1991; 师光禄等, 2000; 张锋等, 2019a)、种群空间分布和遗传分化(黄维正和李东成, 1993; 阎雄飞等, 2014; 洪波等, 2019; 张锋等, 2019b)、物理阻隔和化学防治(高永强等, 2009; 唐雪亮等, 2013; 杨斌等, 2019)等方面，而关于枣飞象和寄主化学通讯方面的研究不多。前期有学者发现，枣芽为释放引诱物质吸引枣飞象的活性部位，不同品种枣树对枣飞象成虫具有不同的引诱活性(阎雄飞和李善才, 2012; 王晶玲等, 2017)；阎雄飞等(2017)测定了枣飞象对枣树7种挥发性物质的电生理和行为反应，发现枣飞象对罗勒烯和α-法尼烯有明显正趋向作用。而关于不同品种枣树化学指纹谱如何，还有哪些挥发性物质对枣飞象具有引诱作用，目前尚未见系统的研究报道。基于此，本研究对5个品种枣树的挥发性物质进行了采集、鉴定和比较，研究了枣飞象对不同品种枣树挥发性物质的触角电位(electroantennogram, EAG)和行为反应，以期发现寄主挥发性物质在枣飞象成虫化学通讯中的作用，为枣飞象植物源引诱剂的开发提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1供试植物材料：试验所用枣树Z.jujuba品种为木枣、狗头枣、赞皇枣、骏枣和酸枣。供试枣芽于2018年4月20日采集自位于陕西省榆林市佳县上高寨乡的榆林市植物保护重点实验室的实验基地。

1.1.2供试昆虫：枣飞象的种群采集自陕西省佳县刘国具镇王元村枣园(38°12′44.53″N, 110°25′7.12″E)，2018年3月下旬，将采集到的枣飞象蛹带回榆林市植物保护重点实验室，在温度20±1℃、相对湿度60%±10%、光周期14L∶6D的人工气候箱内培养，待羽化为成虫后，选择生长健康、大小一致的枣飞象成虫供试。

1.1.3供试挥发性物质：采用顶空吸附和气质联用(GC-MS)，从5个品种枣树的枣芽中共分离鉴定出26种挥发性物质，去除前期已经测试过的7种挥发性物质(阎雄飞等, 2017)，且试剂公司能够提供和合成，最后筛选出17种挥发性物质于试验。供试的挥发性物质的名称、纯度和来源见表1，分别用液体石蜡将供试挥发性物质配制成100 μg/μL 的溶液，液体石蜡(分析纯)购买自上海亚亦生物有限公司。

表1 供试17种挥发性物质的名称、纯度和来源

1.2 挥发物的采集和鉴定

枣芽挥发性物质的采集参考Zhang等(2019)的方法，利用顶空吸附装置进行采集。顶空吸附装置主要包括：QC-2B大气采样仪(北京北京市劳动保护科学研究所)、自制的圆柱玻璃缸(Φ20 cm×25 cm)、气体吸附管(Φ0.6 cm×12 cm，用100 mg Porapak Q吸附剂填充)和活性碳过滤装置；装置各个部件用聚四氟乙烯管连接，形成一个顶空吸附系统。气体流经的顺序依次为大气采样仪，活性碳过滤装置，自制的圆柱玻璃缸、吸附管、大气采样仪。每次称取新鲜枣芽150 g置于自制的圆柱玻璃缸中，排出空气后，调节气体流量为250 mL/min，连接吸附管对枣芽挥发物采集，12 h停止采集。空白对照为空样品缸，采集时间和程序同上，重复称取和采集枣芽挥发物3次。气体吸附管用2 mL正己烷(色谱纯)洗脱，将洗脱液浓缩为1 mL样品液，置于-10℃冰箱中保存用于GC-MS鉴定。

采用美国安捷伦公司气相色谱-质谱联用仪(型号: 7890B-5977B)进行挥发性物质的鉴定，用NIST 2014谱库自动检索，结合标准品质谱图和保留时间对挥发性物质进行定性分析，用峰面积归一法计算每种挥发性物质的含量。气相色谱工作条件：采用毛细管柱为DB-5(30 m×0.25 mm×0.25 μm)采用不分流进样，进样量为1 μL，进样温度: 280℃，载气为氦气，流速为流速1 mL/min。起始温度为50℃，停留3 min，以10℃/min升迅速升至300℃，停留5 min。质谱工作条件：EI离子源，70 eV，接口温度为280℃；离子源温度为230℃；四级杆温度为150℃；采用扫描方式为全扫描；质量范围: 20～500 amu。

1.3 枣飞象触角电位测定

枣飞象触角电位(EAG)测定参考严善春等(2006)和李为争等(2013)的方法。将枣飞象的头部用解剖刀切下，切掉鞭节末节，用镊子将触角两端分别粘在参比电极和记录电极上。将滤纸用消毒眼科剪裁成宽2.5 mm、长3 cm的纸带，将20 μL待挥发性物质滴在滤纸条上，置于巴斯德管中，用封口膜将两端封闭。然后调试仪器，巴斯德管尖端与触角垂直，连续气体的流量为450 mL/min，待基线平稳后，开始进行测定，脉冲刺激气体流量为120 mL/min，每种挥发性物质刺激时间为0.5 s，为了消除触角连续刺激带来的系统误差，两次刺激间隔时间约70 s。相同浓度不同挥发性物质测试顺序随机选定，同种物质测试顺序为由低浓度到高浓度，以液体石蜡作为对照;将每一种挥发性物质测定值的平均值除以前后两次对照测定值的平均值即得EAG反应相对值；每种物质测试重复5次。供试的枣树挥发性物质分别用液体石蜡配制成0.1, 1, 10，50和100 μg/μL 5种不同浓度的溶液。

1.4 枣飞象室内行为测定

枣飞象成虫室内行为测定，参考宁眺等(2006)和王保新等(2014)的方法稍有改动。利用风洞装置即Y型嗅觉仪进行枣飞象成虫行为测定。Y型嗅觉仪的组成构件：Y型玻璃管(主臂长12 cm，外部管径为28 mm；支臂长10 cm，外部管径为24 mm，两个支臂之间角度为60°、味源瓶、气体调节计，流量显示仪、蒸馏水加湿装置、大气采样仪、干燥过滤塔。所有部件用四氟乙烯管连接，气流的方向为依次为：活性炭干燥过滤塔、大气采样仪、蒸馏水加湿装置、气体流量控制计、味源瓶，然后通入Y型管中。

将整个嗅觉仪测定装置，放置于LED灯下，整个装置力求光照均匀，光强为300 μmol/m2·s。将滴有20 μL测试样品的滤纸放入样品室内，开启大气采样仪，调整气体调节计让两支臂的气流为120 mL/min，气体平稳3 min，打开进虫口，引入1头枣飞象成虫，关闭进虫口，待枣飞象进入主臂计时，当枣飞象成虫进入任何一测试臂，停留时间超过20 s或者超过支臂长度2/3，记录枣飞象成虫为有效选择。如果枣飞象停留或者徘徊在主臂的时间超过4 min，则记录为无反应成虫。枣飞象每10头即为一组，每测定4头枣飞象，将Y型管两支臂互换，每10头枣飞象成虫测定完毕，用95%乙醇清洗所有玻璃管件，置于蒸馏水中浸泡，烘干，重复上述试验。根据如下公式计算反应率和选择率。

反应率(%)=(选择对照总虫数+选择味源总虫数)/测试总虫数×100%;

选择率(%)=选择味源总虫数/(选择对照总虫数+选择味源总虫数)×100%。

1.5 数据分析

采集到的数据采用DPS 7.5软件进行统计分析，利用单因素方差分析Duncan氏多重比较法，进行不同挥发性物质之间EAG差异显著性检验和同一物质不同浓度之间的EAG差异显著性检验，利用t检验分析雌雄虫对同种挥发性物质触角电位反应差异显著性，利用卡方检验法比较选择气味源成虫和选择对照源成虫的差异性。

2 结果

2.1 不同品种枣树挥发性物质的鉴定分析

5个枣树品种枣芽挥发性物质成分和相对含量见表2。由表2可知：5个品种枣树的枣芽共鉴定出挥发性物质成分6类26种，包括9种萜烯类、6种酯类、4种醇类、4种烷类、2种醛类和1种酚类。狗头枣和酸枣所含挥发性物质为25种，木枣为24种，骏枣和赞皇枣为23种，同一种物质在不同品种之间存在差异，其中罗勒烯的含量最高均大于20%。

表2 5个枣树品种枣芽挥发性物质成分和相对含量

2.2 枣飞象对枣树挥发性物质的触角电位反应

枣飞象对17种枣树挥发性物质的触角电位反应试验结果见表3。由表3可知：枣飞象对不同枣树挥发性物质触角电位反应相对值(EAG)相差较大。枣飞象对D-柠檬烯、正十三烷、正十四烷、正十五烷、壬醛、棕榈酸甲酯和油酸甲酯7种挥发性物质EAG反应相对值在0.52～3.47之间，说明枣飞象对这7种化合物反应较强。枣飞象对α-蒎烯、α-荜澄茄油烯、异丁醛、正辛烷、芳樟醇、1-戊烯-3-醇、水杨酸甲酯、丁香酚、乙酸叶醇酯和邻苯二甲酸二丁酯10种挥发性物质EAG反应相对值在0.01～0.06之间，说明枣飞象对这10种化合物反应非常弱。选择D-柠檬烯、正十三烷、正十四烷、正十五烷、壬醛、棕榈酸甲酯和油酸甲酯7种挥发性物质用于不同浓度枣树挥发性物质的触角电位反应。

表3 枣飞象雌雄成虫对17种枣树挥发性物质的触角电位反应

2.3 枣飞象对不同浓度枣树挥发性物质的触角电位反应

枣飞象对不同浓度枣树挥发性物质的触角电位反应试验结果如表4。由表4可以看出：枣飞象成虫对不同挥发性物质的EAG反应相对值，在不同挥发性物质之间和同种挥发性物质不同浓度之间均存在一定差异。当挥发性物质刺激浓度为0.1 μg/μL时，枣飞象对各种挥发性物质EAG反应相对值显著低于其他浓度(P<0.05)；当挥发性物质刺激浓度增加到1 μg/μL时，枣飞象对各挥发性物质反应均有不同程度提高，当挥发性物质刺激浓度增加到10 μg/μL时，枣飞象成虫对各挥发性物质EAG反应相对值继续增加。当挥发性物质刺激浓度增加到50 μg/μL时，枣飞象对各挥发性物质的EAG反应相对值达到最大，且显著高于其他浓度(雌虫对正十五烷除外)(P<0.05)，说明枣飞象对各种挥发性物质反应达到最强。当挥发性物质刺激浓度增加到100 μg/μL，各种挥发性物质EAG反应相对值有不同程度下降。

表4 枣飞象雌雄成虫对不同浓度的7种枣树挥发性物质的EAG反应

枣飞象成虫对7种挥发性物质触角电位反应结果见图1。由图1可以看出，枣飞象雌、雄成虫对7种挥发性物质EAG顺序均为：棕榈酸甲酯>壬醛>柠檬烯>十五烷>十四烷>十三烷>油酸甲酯，在该浓度下，枣飞象雌成虫对棕榈酸甲酯和壬醛EAG反应相对值分别为3.84和3.67，雄成虫对棕榈酸甲酯和壬醛EAG反应相对值分别为3.47和3.21，极显著高于对其他挥发性物质的EAG反应相对值(P<0.01)；其次为柠檬酸和正十五烷，二者EAG反应相对值差异不显著(P>0.05)，枣飞象雌雄成虫对油酸甲酯和十三烷EAG反应相对值显著低于对其他挥发性物质(P<0.05)。此外，雌虫引起的触角电位反应值均高于雄虫，其中雌雄虫对棕榈酸甲酯的反应值差异显著(P<0.05)。

图1 枣飞象成虫对7种枣树挥发性物质触角电位(EAG)反应

2.4 枣飞象成虫对枣树挥发性物质的行为反应

枣飞象雌和雄成虫对7种枣树挥发性物质的行为反应试验结果见图2。由图2可以看出：枣飞象雌雄成虫对棕榈酸甲酯选择率最高分别为70.59%和67.65%，其次为α-壬醛选择率分别达到69.77%和65.85%。χ2检验表明，枣飞象成虫选择棕榈酸甲酯和壬醛气味源的总虫数与选择对照总虫数差异均达到显著水平(P<0.05)，说明雌雄成虫对壬醛和棕榈酸甲酯有明显正趋性。枣飞象雌雄成虫对十五烷选择率分别为54.05%和68.42%，且雄虫对十五烷气味的选择与对照相比差异显著(P<0.05)，雌虫对十五烷气味的选择与对照相比差异不显著(P>0.05)，说明雄虫对十五烷有明显正趋性。枣飞象对柠檬烯、十三烷、十四烷和油酸甲酯的选择率为41.67%～59.46%，且枣飞象雌雄成虫对这4种物质的反应与对照相比差异均不显著(P>0.05)，说明枣飞象成虫对柠檬烯、十三烷、十四烷和油酸甲酯无明显趋性。

图2 枣飞象雌(A)和雄(B)成虫对7种枣树挥发性物质的行为反应

3 讨论

枣飞象是为害枣树的一种重要食芽害虫，枣芽挥发物在枣飞象和枣树的化学通讯中起着重要的作用(阎雄飞和李善才, 2012; 王晶玲等, 2017)。迄今为止，关于枣芽的挥发性组分尚未见公开报道，本研究对5个品种枣树的枣芽进行了挥发物采集和鉴定，发现5种枣芽共有6类26种，成分为萜烯类、酯类、醇类、烷类和酚类，不同品种枣树枣芽的挥发性物质种类和含量均有一定差异，这和枣树品种在长期的人工驯化过程中，本身属性发生变化有一定关系。同韩颖(2010)等对枣树幼叶期挥发性物质报道相比，发现枣树幼叶挥发性物质含量最高的为萜烯类，这与本研究结果类似。但是本研究鉴定出的正十三烷、正十四烷、正十五烷、棕榈酸甲酯、壬醛、异丁醛、油酸甲酯等挥发性物质，在枣树的幼叶中均没有发现，这些物质可能是枣芽的特异性挥发组分，对枣树挥发物的进一步研究提供了基础数据。需要说明的是，本研究采用顶空吸附法对采集的枣芽进行了挥发物收集，枣芽为离体状态，挥发性物质和自然状态下肯定存在一定的差异，究竟枣芽在自然状态下和离体状态下挥发性物质的挥发性指纹谱有何差异，有待进一步研究。寄主植物释放出数十种到几百种挥发性物质，其中只有少数几种活性物质能引起昆虫行为反应(Visser, 1986; 李为争等, 2015)。昆虫触角电位技术(EAG)能够直接记录昆虫对挥发性物质的电生理反应，具有很高的灵敏性和选择性，是筛选昆虫信息素和植物活性物质的主要技术(闫凤鸣, 2011)。本研究发现枣飞象对D-柠檬烯、正十三烷、正十四烷、正十五烷、壬醛、棕榈酸甲酯、油酸甲酯的反应较强，对其余10种物质的反应非常弱，筛选出7种挥发性物质用于不同浓度触角电位试验和行为测定。一般说来，昆虫对挥发性物质的反应具有浓度阈值，低于或高于这一阈值，昆虫的反应就会下降(王霞等, 2009; 李俊龙等, 2019)。例如绿豆象Callosobruchuschinensis对挥发性物质反应最强浓度为100 μg/μL(王宏民等, 2017)，华北大黑鳃金龟Holotrichiaoblita和铜绿丽金龟Anomalacorpulenta对挥发性物质反应最强浓度均为10 μg/μL(邓思思等, 2011; 谢明惠等, 2015)。本研究发现，枣飞象对挥发性物质EAG反应最强浓度为50 μg/μL，在此浓度下，枣飞象成虫对棕榈酸甲酯和壬醛EAG反应相对值显著高于其他挥发性物质，对油酸甲酯EAG反应相对值明显低于其他挥发性物质；说明枣飞象对枣树挥发性物质反应有广泛性和特异性。在触角电位反应结果中还发现，大部分枣飞象雌虫的触角电位EAG反应值高于雄虫，在香蕉象甲Cosmopolitessordidus(Budenbergetal., 1993)、甘薯蚁象(贾小俭等, 2017)、绿豆象(王宏民等, 2017)等植食性象甲也得到了同样的研究结果，说明雌虫对挥发性物质反应比雄虫更为敏感，这可能和雌虫还承担产卵功能相关。

昆虫的触角电位反应仅表示枣飞象对挥发性物质的敏感程度，行为测试才能确定挥发性物质的具体作用(Cook, 2007)。本研究发现壬醛对枣飞象成虫有明显的吸引作用。壬醛能够吸引很多鞘翅目昆虫，在植食性昆虫的寄主定向过程中起着重要作用。如甘薯蚁象(贾小俭等, 2017)、铜绿丽金龟(谢明惠等, 2015)、桑天牛Aprionagermari(马艳等, 2018)、槐绿虎天牛Cosmopolitessordidus(陈艳萍等, 2016)，说明壬醛是植食性昆虫一种比较广谱的植物源引诱物质。棕榈酸甲酯对枣飞象有明显引诱作用，目前关于棕榈酸甲酯吸引植食性昆虫方面，尚未见报道，说明棕榈酸甲酯可能是吸引枣飞象的特异性物质，在枣飞象寄主选择过程中起着重要的作用。正十五烷对枣飞象雄虫有明显吸引作用，对雌虫吸引作用不明显，这种同一物质在雌雄两性昆虫作用具有差异，在绿豆象(王宏民等, 2017)、甘薯蚁象(贾小俭等, 2017)、茶丽纹象Myllocerinusaurolineatus(Sunetal., 2010)等植食性象甲存在类似的研究结果。有学者报道雄虫对性信息素类似物比雌虫更敏感的原因是雌虫为繁殖后代需要寻找食物、和产卵场所(陈展册等, 2010)。引起植食性象甲这种现象的原因究竟是什么，需要进一步研究。

寄主植物释放的挥发性物质在植食性象甲搜寻寄主、补充营养、产卵等行为活动中发挥着重要作用(Hare, 2011; 赵艳等, 2014)。油菜释放出的4-戊烯基异硫氰酸酯、3-丁烯基异硫氰酸酯和2-苯乙基异硫氰酸酯的混合物是白菜籽龟象Ceutorhynchusassimilis寻找寄主的化学指纹谱(Bartletetal., 1993)；茶树释放的罗勒烯、法尼烯、顺式-3-己烯醋酸酯和芳樟醇是茶丽纹象识别嗜好茶树品种的指纹谱(Sunetal., 2010)；长足大竹象Cyrtotrachelusbuqueti识别补充营养寄主竹笋依靠苯甲醛为主的化学指纹谱(杨桦等, 2010)。枣飞象和寄主植物的化学通讯过程比较复杂，是枣飞象对枣树气味化学指纹谱综合识别和反应的过程。我们前期的研究表明罗勒烯和α-法尼烯对枣飞象有明显吸引作用(阎雄飞等, 2017)。到目前为止，共筛选出4种挥发性物质对枣飞象有明显的吸引作用，为枣飞象植物源引诱的开发提供了基础资料。研究单一挥发性物质对枣飞象的作用仅是研究植物源引诱剂的前期工作，今后若能将罗勒烯、α-法尼烯、壬醛和棕榈酸甲酯按照一定比例和含量进行组合，通过室内嗅觉生测和田间诱捕试验，筛选出具有田间效果的植物源引诱剂配方，将对监测和有效控制枣飞象具有重要实践意义。