丝光绿蝇蛹壳颜色变化及其对死后间隔时间推断的意义

王 贺, 唐 晁, 齐莉莉,*, 董春楠, 宋兆昱, 任晓鹏

(1.河北医科大学病原生物学教研室, 石家庄 050017; 2.河北医科大学检验技术学院, 石家庄 050000)

死后间隔时间(postmortem interval, PMI)一直是法医学研究的热点之一，而法医昆虫学的发展为PMI的推断开辟了新途径(胡萃, 2000)。尸食性蝇类是人类尸体腐败过程中，最早出现在尸体上的昆虫之一，它们可以在尸体上产卵并孵化成幼虫最后化蛹，这一过程中，尸体的很多信息会“记录”在它们体内，通过研究蝇的各种指标找到这些信息从而为侦破案件提供依据正是法医昆虫学家的主要任务(李学博等, 2013)。目前，关于尸食性蝇类的研究多集中在了幼虫期，而蝇蛹往往是案件现场尸体周围发现率最高的虫态之一(马孟云等, 2016)，因此，蛹期的研究至关重要。

蝇蛹的蛹壳颜色自化蛹后呈现规律性变化，可作为蝇蛹日龄的良好指标(Greenberg, 1985)，因此，利用蛹壳颜色变化推测死亡时间将是一种简便易行的办法。国内关于案发现场尸食性蝇类蛹期的发育形态研究不少(王江峰等, 2002)，而蛹壳颜色变化的研究不多。本研究旨在探寻一种将蛹壳颜色变化具体量化从而更加准确地反映蛹期发育时间的方法，为PMI的推断提供新思路。丝光绿蝇Luciliasericata是最常见的尸食性蝇类之一，也是石家庄市优势蝇种，对其蛹期的深入研究可为石家庄市蝇类研究和在法医学上的应用积累资料。

1 材料与方法

1.1 标本采集与饲养

在位于石家庄长安区的河北医科大学校园内以大鼠内脏诱捕成蝇，带回实验室，按照《中国蝇类检索表》(范滋德, 1997)系统进行鉴定分类，选取丝光绿蝇放入养蝇笼内，置于MGC-300B型智能光照培养箱(温度28℃，相对湿度50%～60%，光周期为12L∶12D)内饲以清水、奶粉与糖混合物(1∶1, m/m)，并两天更换一次，以保持干净新鲜。饲养至第3代作为实验虫源。

用猪肉诱蝇产卵分别置于16, 20, 24, 28和32℃的培养箱(MGC-300B型)内饲养幼虫直至其化蛹，随机选取10头蛹移至盛有2/3细沙的90 mm灭菌培养皿中，两蛹之间间隔≥15 mm，各蛹朝向角度一致，保持细沙湿度。

1.2 提取蛹壳颜色数据

自化蛹起每间隔12 h，取出蝇蛹进行观察拍照。拍照环境为：室内自然光线，距工作台上方垂直500 mm高度处放置LED补光灯。用软毛刷轻扫蛹体后用镊子轻轻逐个夹取蝇蛹至体视显微镜(OLYMPUS-SZ61)的载物台上，依次拍照，分别留取不同恒温下的蛹壳颜色图片。拍照完的蝇蛹再次放回培养皿中，置回原培养箱，待12 h后重复上述步骤直至羽化。将图片导入图像分析系统中，做图片预处理后，在窗口下选择“颜色”选择框，利用“颜色取样器”(颜色取样器选项栏中的取样大小设定为5×5，即一次读取5×5像素区域的平均值)随机在蛹壳上选取50个像素点，读取颜色数据，分别记录颜色板中的RGB值，取各自均值作为该恒温下每间隔12 h的丝光绿蝇蛹壳颜色的标准RGB值。

1.3 制作色板和回归分析

将不同恒温下蛹壳颜色随发育时间变化的标准RGB值导入图像分析软件中，使用“颜色板”工具，制作与发育时间一一对应的蛹壳颜色标准色块，并将色块保存至各温度下的文件夹。在Word文档中打开各色块文件，调整至相同大小，按发育时间排列，制作各恒温下的蛹壳颜色标准色板。采用R软件对蛹发育时间与蛹壳颜色RGB值中的R值的关系进行多元回归分析和拟合。

1.4 数据分析

本研究测得数据的处理使用Excel软件和R软件(ver.3.6.3)，图片处理使用Adobe Photoshop cc2017和Motic Image Advanced 3.2软件。

2 结果

2.1 丝光绿蝇蛹壳颜色变化规律

在不同恒温条件下，丝光绿蝇的蛹壳颜色随发育时间总体呈逐渐加深趋势，但此变化不均匀，开始为浅白黄色或淡黄色，很快变为黄褐色至红褐色，红褐色蛹壳占据蛹期大部分时间，直到临近羽化，由于透过蛹壳可看到内部蛹体组织，此时的蛹已全身布满黑褐色鬃毛，所以蛹壳颜色变至最深呈黑褐色。可见，蛹壳颜色在化蛹初期和临近羽化时变化较大，在一定的温度范围内，温度越高，蛹的发育历期越短，蛹壳颜色变化趋势也越快(图1)。

图1 不同恒温下丝光绿蝇蛹壳颜色标准色板

2.2 蛹壳颜色RGB值的变化

各恒温下蛹壳颜色的RGB值(表1)随发育时间均呈下降趋势，尤其在化蛹初期及临近羽化时更明显；RGB值的变化幅度也有差异，其中R变化最明显，是蛹壳颜色变化的主导，而B变化最平缓，大致呈减低趋势。随温度升高，蛹壳RGB值的变化历期越短。采用R软件进行多元回归分析和拟合，结果RGB值中以R值与时间的拟合度最佳，建立的多项式回归方程为:x=β0+β1y+β2y2+β3y3，其中y为发育时间(h)，x即该发育时间对应的蛹壳颜色RGB值中的R值。各温度下三次函数拟合效果均佳，经方差分析均有统计学意义(P<0.01)(表2)。

表2 不同恒温下丝光绿蝇蛹壳颜色RGB值中的R值与发育时间的拟合方程

2.3 蛹壳颜色的标准色板

根据RGB值(表1)，利用图像处理软件得到不同恒温下丝光绿蝇蛹壳颜色的标准色板(图1)。

表1 不同恒温下丝光绿蝇蛹壳颜色的RGB值

由RGB值和绘制的标准色板可得出：在不同恒温、其余生存条件相同的条件下，丝光绿蝇蛹壳的标准色板由淡黄色渐至红褐色直至黑褐色，这一变化是连续但不均匀的，红褐色色板占据蛹期大部分时间；温度越高，色板数量越少，表明蛹发育历期越短，温度越低，色板数量多，发育历期越长。RGB值随时间延长数值越低，导致蛹壳色板越暗。

3 讨论

近年来，法医昆虫学发展迅速，国内外很多学者对尸食性蝇类的蛹期形态发育进行过研究，Greenberg曾提出根据蛹壳颜色变化的过程，建立一个颜色与化蛹后时间一一对应的色板，再以待检蛹壳与标准色板对比，即可得出蝇蛹日龄的想法(Greenberg, 1995)，但未见后续。国内Ma等(2015)对大头金蝇Chrysomyamegacephala、巨尾阿丽蝇Aldrichinagrahami等蝇蛹的发育形态做了详细研究，积累了宝贵资料，同时也观察到化蛹后蛹壳颜色由淡黄色至红褐色，之后逐渐加深的现象，并提出根据蛹壳的颜色可进一步更准确地推断死亡时间。笔者一直致力于尸食性蝇蛹蛹期的发育形态学研究，对蛹壳颜色也做了些初探性试验研究，发现记录蛹壳的颜色变化可得到有价值的时间证据(王贺, 2007)。本实验为进一步研究将蛹壳的颜色变化标准化的方法，通过试验方法的改进更准确地捕捉蛹壳颜色变化的信息数据，以增强此法实际应用的可靠性。

首先，蛹壳标本的选取方法。通常的蝇蛹发育学研究都是按一定的时间间隔定期留取标本，这种方法存在蛹发育不同步的问题，样本量足够大的情况下，可以忽略。但以往的实验，我们发现留取大量标本很难实现，尤其在发育历期较长的温度下。此次实验我们改变采集标本方法，即开始化蛹时选取10头发育基本同步的蛹，对其定期持续观察，即以活蛹为标本采集颜色信息。此法需要注意每次取蛹动作轻柔，以保证其存活至羽化。以后的实验可以增加标本量，使获得的RGB值更准确。

其次，蛹壳RGB值的影响因素。本实验利用图像分析软件对不同发育阶段的蛹壳随机选取像素点，提取各个像素点的RGB值，分别取均值作为该温度该发育时间的蛹壳颜色的标准RGB值，像素点的选择区域由最初的胸背局部范围扩大到全蛹，像素点数量也增多至50个，蛹体颜色是一个成千上万RGB混合而成的复合颜色，像素点的样本量越大，色板才能越真实地反映蛹壳颜色。通常情况下，RGB各有256级亮度，用数字表示为从0, 1, 2, …, 255，因此RGB组成有千万种，用其表示色彩是相当灵敏的，我们对实验条件严格要求，以尽量减少采集图像、读取RGB值过程中的偏差，保证标准色卡的使用可靠性：(1)拍照环境的光照强度保持恒定。我们采用工作台设置补光灯的方法，补光灯参数为20～30 W，色温为3 200～5 000 K，显色指数Ra≥95，距桌面垂直高度500 mm左右，以尽量减少环境光线变化对图片色彩的影响。(2)应用图像分析软件采集图片和读取RGB值时，应先进行白平衡校对，并将所有图片的色阶、对比度、色调等以参照卡[图像软件中RGB配色表分量均为190的灰色(Grey)色卡]为标准进行校正。我们建议，标准色板可用于初筛，将待检蛹与色板进行目视比色，粗略估算蛹期，要精确推断日龄，可按上述试验方法提取待检蛹壳的RGB值，参考各温度下R值的曲线拟合方程，可获得发育时间，同时可结合蛹内形态发育或其他生理生化指标(郑娜等, 2016)。近几年很多学者不断尝试，如利用影像诊断技术CT等来观察蛹内部发育以推断蛹期(Hall, 2017)，为蛹期发育研究开辟了新思路。

本实验观察到红褐色蛹壳存在时间较长，我们曾竭力试图将红褐色阶段再分，但由于此阶段颜色变化视觉差甚小，肉眼难以区别，这与Greenberg(1995)的蛹壳从白色到红褐色的转变可提供前10个多小时的颜色标志的结论相似。可见，利用蛹壳颜色推断蛹期的方法在化蛹初期和临近羽化阶段意义较大，但这两个阶段蝇蛹的变化异常迅速，难以捕捉，后续的实验可重点集中在此，持续观察争取采集到有意义的时间信息。实际案例中，蛹壳颜色变化受到许多外界因素影响，而案发现场的温度对于蛹期的生长发育有着重要影响(Michaudetal., 2012)。因此，本实验设置了不同恒温的基础条件来为实际案例中应用标准色板提供可参考的依据。有关实际情况下环境光照、湿度等因素对蛹期发育的影响等问题有待进一步研究(杨帆等, 2015)。本实验表明蝇蛹的颜色变化可作为比较直观的判断依据。利用蛹壳颜色推断蛹期，不需要复杂的专业知识，操作技能和高端的仪器设备，简便实用，将待检蛹壳与本研究得到的标准色板进行目视比色，可粗略快速推测蝇蛹发育时间，为死后间隔时间的推断提供较科学的依据，具有一定实用价值。