黄瓜叶酸合成关键基因克隆与分析

周琪，刘小萍，薄凯亮，苗晗，董邵云，顾兴芳，张圣平

（中国农业科学院蔬菜花卉研究所/农业农村部园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京 100081）

0 引言

【研究意义】叶酸是人体生命活动必需的水溶性B族维生素，其分子由蝶啶、对氨基苯甲酸和谷氨酸残基三部分组成[1]。根据取代基的不同，叶酸分为不同的种类，目前在动植物中已发现的叶酸种类有50多种[2-3]。叶酸参与核苷酸的生物合成、氨基酸代谢和甲基化循环，是细胞内主要的甲基供体，对DNA的合成、甲基化和修复至关重要[4-6]。美国食品和营养委员会推荐叶酸的摄取量成年人为400 μg·d-1，孕妇为600 μg·d-1。叶酸缺乏会引发巨幼红细胞贫血和老年人认知功能障碍等疾病[7-8]。但人体无法自身合成叶酸，必须依赖饮食摄入。与水稻、谷子等作物相比，蔬菜中叶酸含量较高，成为人体摄入叶酸的主要来源[9-10]。由于烹饪加热过程会导致叶酸降解[11-13]，黄瓜以生食为主，能使其含有的叶酸不经烹饪降解而最大限度地保留，被人体吸收利用，成为人体补充叶酸的最佳选择之一。黄瓜中叶酸合成代谢的分子生物学研究尚未见报道，研究黄瓜果实的叶酸合成代谢具有重要意义。【前人研究进展】植物中叶酸代谢途径分为喋啶分支和pABA分支[3]。GTP在细胞质中形成喋啶，ADC在叶绿体中裂解生成pABA，随后二者被转入线粒体中形成二氢蝶酸，经谷氨酸化和还原反应形成四氢叶酸，最后通过加尾作用形成多尾叶酸[14-15]。在蝶啶分支中，GTP环化水解酶（GTPCHI）是催化第一步反应的酶，也是该分支的限速酶，调控该酶的基因为GCHI[16-18]。在pABA分支中，氨基脱氧分支酸合酶（ADCS）是其限速酶[19]，由基因ADCS调控合成。GTP环化水解酶与氨基脱氧分支酸合酶被认为是限制植物叶酸合成途径的两个关键酶[20]。黄瓜是我国的重要蔬菜作物，尤其在设施生产中占有举足轻重的地位，2017年收获面积为123.52万hm2，产量达到6 482.46万t[21]。我国黄瓜以鲜食为主，能使其含有的叶酸得到最大限度的保留而被人体吸收利用。【本研究切入点】模式植物拟南芥中叶酸合成代谢相关研究较为深入，关于黄瓜叶酸代谢调控以及叶酸合成关键酶基因的克隆与表达分析尚未见报道。【拟解决的关键问题】本研究参考拟南芥调控叶酸合成代谢基因的蛋白序列，BLAST得到黄瓜的同源基因，并完成其在染色体上的定位。利用荧光定量PCR技术分析这些基因在测序黄瓜果实发育不同时期以及果实叶酸含量高低差异显著的2份材料中的表达量。通过蛋白序列比对、结构域分析以及进化树构建，分析调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因的序列保守性，并克隆这两个关键酶基因，分析其序列在不同材料中的差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验材料为完成全基因测序的黄瓜自交系9930，以及果实叶酸含量高低差异显著的2份自交系5G（低）和02245（高）。试验材料于2018年春、秋两季种植于中国农业科学院南口试验基地连栋大棚（北京），前期正常管理，9930黄瓜果实发育不同时期叶酸含量测定：开花前2 d、开花当天、开花后7 d、开花后14 d、开花后21 d果实中的叶酸含量。65G和02245的果实叶酸含量测定在植株盛瓜期取样，且选取植株中部节位、大小合适的商品瓜。

1.2 试验方法

1.2.1 黄瓜叶酸合成代谢相关基因鉴定 根据文献[8]和TAIR数据库（https://www.arabidopsis.org/）获得拟南芥与叶酸合成代谢相关基因的蛋白序列，利用BLAST方法在黄瓜9930_V3基因组上寻找相似性较高的同源基因。再通过BLAST，将这些基因比对到拟南芥TAIR10基因组中，获取具体的基因名称。采用MapChart软件绘制黄瓜叶酸代谢相关基因在染色体上的物理位置。

1.2.2 黄瓜材料取样方式及叶酸含量测定 每一份材料3个生物学重复，每个重复选取3条瓜，每个瓜上、中、下部位切取3个薄片，用液氮速冻。同一个生物学重复的样品混合均匀并研磨成粉末，利用双酶法提取叶酸，利用液相色谱三重四级杆质谱联用仪测定叶酸含量[22]。

1.2.3 总RNA的提取与cDNA第一链的合成 果实取样后用锡箔纸包裹于液氮中速冻，然后用研钵将其研磨成粉末。根据TaKaRa的RNA提取试剂盒提取RNA，利用Nanodrop2000核酸仪检测其浓度，并经凝胶电泳检测其完整性，质量合格的RNA可观察到两条清晰明亮的带型。之后取适量的RNA，同时使用反转录试剂盒合成cDNA第一链。

1.2.4 黄瓜叶酸合成基因在果实发育不同时期及不同材料中的表达量分析 以反转录cDNA为模板，以黄瓜中稳定表达的基因（Csa_2G301530）为内参基因，针对基因功能序列分别设计引物（附表2），尽量保证引物无二聚体、发夹结构等。利用TaKaRa SYBR®Premix Ex Taq™II试剂盒（北京六合通经贸有限公司）对9930果实发育不同时期以及果实叶酸含量高低差异显著的65G和02245中的基因进行实时荧光定量分析，采用F=2-△△Ct法分析其表达量[23]。

1.2.5 黄瓜叶酸合成关键酶基因的蛋白序列比对及系统进化树构建 从NCBI上搜索各物种叶酸合成关键酶GTPCHI及ADCS同源基因的蛋白序列，利用MEGA软件对序列进行比对，构建系统进化树。利用在线软件（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）对5个结构域氨基酸保守性进行分析。

1.2.6 黄瓜GCHI及ADCS的克隆与序列分析 根据黄瓜基因组网站信息（http://cucurbitgenomics.org/organism/3），利用primer 5.0设计引物扩增两个基因（附表1）。建立20 μL的扩增体系，利用高保真酶（南京诺维赞）对两个基因进行扩增。PCR循环条件为，95℃预变性3 min，95℃变性 15 s，60℃退火 15 s，72℃延伸 3 min，35个循环；72℃延伸5 min，10℃保存。每个扩增的基因尽量包含部分3′UTR和5′UTR序列，对于序列过长的基因设计多对引物，分段扩增，每段接头部分有大于100 bp的重合。

扩增产物均用1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，送至上海生物工程有限公司测序。测序结果拼接后，比对分析同一基因在不同材料中的序列差异。

1.2.7 基因的生物信息学分析 利用在线软件Expasy（https://www.expasy.org/）预测黄瓜CsGCHI及CsADCS编码蛋白的等电点及分子量等，利用在线工具WoLF PSORT（https://wolfpsort.hgc.jp/）预测亚细胞定位情况。

2 结果

2.1 黄瓜叶酸合成相关基因

拟南芥中已报道的与叶酸代谢相关的酶共14个，其中大部分酶参与叶酸合成过程，其余为叶酸转运子或与叶酸降解相关（表1）。其中羟甲基二氢蝶呤焦磷酸激酶（HPPK）/二氢蝶呤合成酶（DHPS）是一个双功能酶，催化两步连续的反应[10]。通过基因组数据库获取拟南芥中调控这些酶的基因序列，经BLAST比对寻找黄瓜中的同源基因。得到19个黄瓜中与叶酸代谢相关的基因，其中有11个（标*）参与合成途径，包含了叶酸从头合成的全部反应。

2.2 基因的染色体定位

根据各基因在染色体上的物理位置，利用MapChart软件绘制黄瓜染色体物理图谱并进行基因定位（图1）。结果发现，这19个基因不均匀分布在黄瓜的7条染色体上，其中，4号和5号染色体上最多（4个），1号和3号染色体次之（3个），2、6号染色体较少（2个），7号染色体最少（1个）。除基因CsaV3_2G011840（D）、CsaV3_2G014940（E）、CsaV3_3G021950（F）外，其余大多分布在染色体长、短臂的两端。

表1 黄瓜叶酸合成相关基因Table 1 Folate metabolism related genes in cucumber

图1 黄瓜中叶酸合成相关基因在染色体上的位置Fig.1 The position on the chromosome of genes involving in folate synthesis in cucumber

2.3 9930果实发育不同时期叶酸含量及对应时期的叶酸合成基因的表达量

测定黄瓜自交系9930果实发育不同时期的叶酸含量（图2-a），结果表明，开花当天叶酸含量最高，为42.16 μg/100 g FW，开花21 d的叶酸含量最低，为21.76 μg/100 g FW。叶酸含量的规律表现为，在开花之前呈上升趋势，开花当天达到最高，开花之后呈下降趋势。

图2 黄瓜叶酸合成基因在果实发育不同时期的表达量Fig.2 The expression level of folate synthetic genes in cucumber fruit at different stages

分析与叶酸合成相关的11个基因在9930果实发育不同时期的表达量，从表达量变化趋势来看，在同源基因中，CsGCHI1与CsGCHI2（图 2-c、d）、CsADCL1与CsADCL2（图2-g、h）的趋势一致。CsDHFR1的表达量在整个发育过程中呈下降趋势，而CsDHFR2先上升后下降（图2-e、f）。在开花前，除基因CsDHFR1（图2-e）外的其他基因表达量均上升，与总叶酸含量呈正相关。在开花之后，基因CsDHFR1、CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA在果实发育过程中呈现下降的趋势（图2-b、e、j、l）。在整个发育过程中，基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA、CsADCS与叶酸含量变化趋势完全一致（图2-b、i、j、l）。

2.4 果实叶酸含量高低差异显著材料65G和02245中基因的表达量分析

分别在2018年春季和2018年秋季测定核心种质群体[24]叶酸含量，从中挑选出在两季中叶酸含量比较稳定的两份材料65G及02245，65G果实的平均叶酸含量为21.75 μg/100 g，02245果实的平均叶酸含量36.15μg/100g。差异显著性分析表明，两者总叶酸含量具有显著差异，且65G总低于02245（图3-a）。测定11个叶酸合成相关基因在65G及02245中的表达量，分析发现，基因CsADCL1、CsADCL2、CsDHNA、CsFPGS的表达量具有显著差异，基因CsADCS、CsDHFS、CsHPPK/CsDHPS表达量具有极显著差异（图3-b），且这些基因均在02245中高表达，与叶酸含量正相关。

2.5 黄瓜及其他物种GCHI蛋白质序列分析及进化树构建

在细胞质中，GTPCHI催化GTP合成甲酸和二氢蝶呤三磷酸，这一反应是真核生物合成叶酸喋啶分支的第一步反应，也是该分支的限速步骤[16-18]。黄瓜中控制GTPCHI合成的同源基因是CsaV3_1G041250和CsaV3_7G026240（表1）。这两个基因与拟南芥中该基因蛋白质序列的一致性分别为60%和61%（图4-a）。利用NCBI网站进行BLAST分析得到除黄瓜外8个物种中该基因的蛋白序列，利用MEGA6中的Clustal W对蛋白序列进行比对。结果表明，各物种中GCHI同源基因均含有两个GTP_cyclohydroI结构域，且无论是单子叶植物水稻、玉米还是双子叶植物拟南芥中，该蛋白的结构域高度保守，说明它们可能来自共同的祖先（图4-b）。

对各物种GCHI的氨基酸序列进行系统进化树分析（图4-c），发现同一物种或亲缘关系较近的物种聚在一起，黄瓜首先与其他葫芦科作物甜瓜、西瓜等聚在一起，说明该基因在亲缘关系较近的物种中进化是保守的，可能行使着相同或相近的功能。

2.6 黄瓜及其他物种ADCS蛋白质序列分析及进化树构建

在叶绿体中，ADCS催化叶酸前体4-氨基-4-脱氧络合物（ADC）的生物合成，该步骤是pABA分支的限速步骤[14]，黄瓜中控制该酶合成的同源基因是CsaV3_5G036360。CsaV3_5G036360与拟南芥该基因蛋白序列的一致性为57%。同样通过BLAST找到除黄瓜外10个物种中该基因的同源蛋白序列，蛋白序列比对发现，ADCS含有4个结构域，包括2个GATase，1个Chorismate_bind和1个Anth_synt_I_N结构域（图5-a），这4个结构域在不同物种中高度保守（图5-b—e）。

图3 不同材料叶酸含量及基因表达量分析Fig.3 The folate content in 65G and 02245 and the expression level of folate metabolism related genes

图5 黄瓜及其它物种ADCS蛋白序列比对以及进化树Fig.5 Protein sequences alignment and evolutionary-tree generation of ADCS in cucumber and other species

从ADCS同源蛋白构建的进化树中可以看到，这个基因在进化的过程中十分保守，遵循单子叶植物同源蛋白聚类到一起，双子叶植物同源蛋白聚类到一起的进化原则。黄瓜与同属葫芦科的甜瓜等聚类到一起（图5-f）。表明这个基因在不同植物中的功能比较保守，都催化叶酸前体的合成。

2.7 黄瓜GCHI与ADCS基因全长的克隆与序列分析

分别扩增果实叶酸含量高低差异显著的65G和02245中调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因GCHI和ADCS的序列。结果表明，在两份材料中，CsaV3_1G041250全长均为3 012 bp，CDS长度均为1 413 bp（附图1）。在两份材料中有多个SNP差异位点，有7处变异发生在内含子区域，CDS区有3处突变未引起蛋白质序列的改变，有3处SNP的突变导致了氨基酸序列的改变，第2 474 bp处，65G与02245编辑的氨基酸分别为天冬酰胺和苏氨酸，第2 669 bp处分别为丝氨酸和酪氨酸，第3 018bp处分别为丙氨酸和缬氨酸（图6）。在两份材料中，CsaV3_7G026240全长均为3047bp，CDS长度均为1407bp，在内含子区有一个变异，氨基酸序列无差异（附图2）；Csa5G623430全长均为7 941 bp，CDS长度均为2 706 bp，变异均发生在内含子区域，氨基酸序列无差异（附图3）。

2.8 黄瓜GCHI与ADCS基因的生物信息学分析

黄瓜CsGCHI及CsADCS编码蛋白的等电点（pI）及分子量预测结果表明CsGCHI等电点理论值为6.38，编码468个氨基酸，估计分子量51.621 kD，总平均亲水性为-0.350，说明该蛋白为亲水性蛋白。CsGCHI蛋白分子不稳定参数为37.90，小于40，因此该蛋白是稳定蛋白。CsADCS等电点理论值为5.88，编码901个氨基酸，估计分子量101.17 kD，总平均亲水性为-0.350，该蛋白为亲水性蛋白。CsADCS蛋白分子不稳定参数为44.31，大于40，因此该蛋白是不稳定蛋白。亚细胞定位情况预测结果表明，CsGCHI蛋白最可能定位于高尔基体,而CsADCS蛋白定位于细胞质的可能性最大。

图6 黄瓜CsaV3_1G041250基因在65G、02245中的序列差异Fig.6 The sequence difference of CsaV3_1G041250 between 65G and 02245

3 讨论

拟南芥中已报道的与叶酸代谢相关的酶有14个，分别由26个基因调控[8]。学者们利用同源比对来寻找其他作物中与叶酸代谢相关的基因，其中水稻中14个，番茄中10个。本研究获得19个黄瓜叶酸代谢相关基因，其中11个参与叶酸合成，包括了叶酸从头合成的全部反应过程。这19个基因在黄瓜7条染色体上均有分布，且大多位于染色体长、短臂两端。对番茄果实叶酸合成基因表达模式的研究发现，基因GCHI、ADCS和ADCL随着果实成熟，其表达量逐渐降低，基因DHFR和DHFS的表达在果实发育后期显著升高，而其他基因在不同发育阶段变化不明显[25]。在小麦种子发育过程中，基因GCHI、ADCS的表达量逐步下降，基因FPGS在种子5—30 d的表达量维持恒定，而后迅速降低[20]。在水稻中，GCHI、ADCS和HPPK均在开花期表达最高（不同时期表达变化5—6倍），在乳熟期（5—10 DPA）至种子成熟时期，这3个基因的表达又逐步回升。FPGS在抽穗期表达量最高而后逐步下降[26]。本研究中，在开花之前，CsDHFR1＞CsDHFR2；在开花之后，CsDHFR1＜CsDHFR2。推测CsDHFR1在开花之前起主要作用，CsDHFR2在开花之后起主要作用。在黄瓜中，基因CsADCS、CsGCHI、CsHPPK/CsDHFS与水稻中这些基因的表达趋势类似，在开花当天表达量最高；基因CsFPGS也与小麦和水稻中类似，在果实发育过程中呈下降趋势，推测它们可能受相同或相近的模式调控。尤为重要的是，黄瓜中存在与果实叶酸含量变化趋势完全一致的基因CsDHNA、CsHPPK/CsDHFS、CsFPGS以及CsADCS，推测它们对不同时期叶酸含量变化趋势起主要作用。

叶酸合成分为pABA分支和喋啶分支，pABA分支包括两步反应，分支酸和谷氨酰胺在氨基脱氧分支酸合成酶（ADCS）的催化下生成氨基脱氧分支酸，其产物在氨基脱氧分支酸裂解酶（ADCL）的催化下合成对氨基苯甲酸（pABA）[27]。黄瓜中调控这两步反应的基因CsADCS、CsADCL表达量在65G与02245中均具有显著差异。喋啶分支包括4步反应，GTP在GTPCHI的催化下形成二氢新蝶呤三磷酸（DHN-P3），DHN-P3经两步去磷酸化反应生成二氢新蝶呤（DHN），DHN的侧链在二氢新蝶呤醛缩酶（DHNA）的作用下被切除，释放出二氢蝶啶（HMPHP）[28]。在黄瓜中，调控这4步反应的基因仅CsDHNA在65G与02245中具有显著差异。

随后，pABA分支和喋啶分支的产物转入线粒体中合成四氢叶酸。首先二氢蝶啶在二氢蝶啶焦磷酸激酶（HPPK）的催化下生成具有活性的焦磷酸盐化合物，然后与pABA在二氢蝶酸合酶（DHPS）的催化作用下形成二氢蝶酸（DHP）。随后在二氢叶酸合成酶（DHFS）的催化下形成单尾形式的二氢叶酸。二氢叶酸分别在二氢叶酸还原酶（DHFR）和叶酰多谷氨酰合成酶（FPGS）的催化下形成多尾形式的四氢叶酸[29]。黄瓜中调控这几步反应的基因中，CsHPPK/CsDHPS、CsDHFS、CsFPGS的表达量在 65G与02245中具有显著差异。在整个叶酸合成通路中有6个基因在65G与02245具有显著差异，且在叶酸含量高的材料中，差异基因的表达量也高，基因的表达量与叶酸含量呈正相关。

叶酸的强化主要依靠过量表达叶酸合成过程中的酶实现，GTPCHI和ADCS分别是叶酸合成过程中喋啶分支和PABA分支的限速酶[20]。国内外的学者将控制这两个酶的基因在拟南芥[30]、番茄[31]、水稻[32]中过量表达，叶酸含量均得到了显著提高。因此，在植物中过量表达控制这两个酶的基因，是利用转基因技术提高植物中叶酸含量的有效途径。本研究中，黄瓜CsGCHI两个同源基因氨基酸序列与拟南芥中该酶氨基酸序列的同源性较高。氨基酸序列比对以及结构域分析表明，GTPCHI的结构在整个进化过程中得到了很好的保存。扩增两份不同材料中CsGCHI基因序列，在CDS区找到6个SNP位点的差异，其中有3个导致了氨基酸序列的改变，且都发生在具有GTPCHI催化活性的保守结构域内，但是该基因的表达量没有差异。推测该基因可能通过氨基酸序列的改变行使功能，并进一步影响叶酸含量。黄瓜CsADCS氨基酸序列与拟南芥中该酶氨基酸序列同源性较高，各物种中该基因的蛋白序列高度保守且都具有4个结构域，可能行使相同或相似的功能。

4 结论

本研究成功鉴定出19个不均匀分布在7条染色体上的黄瓜叶酸代谢相关基因，基因CsFPGS、CsHPPK/CsDHPS、CsDHNA和CsADCS是影响黄瓜果实叶酸含量变化，导致叶酸含量高低显著差异的关键基因。调控叶酸合成限速步骤的关键酶基因CsGCHI及CsADCS功能相对保守，CsGCHI在黄瓜65G、02245中有3个SNP位点的突变导致了氨基酸序列的差异。本研究明确了相关基因在黄瓜果实发育不同时期以及不同材料中的表达量差异，分析了关键酶基因的序列差异，为揭示黄瓜叶酸合成代谢调控网络奠定了基础。

致谢：感谢中国农业科学院生物技术研究所公共实验室韩丽妲老师及实验室成员万幸、杨敏等对黄瓜果实叶酸含量测定提供的帮助！