miR-581在食管鳞癌中的表达及其对食管鳞癌K30细胞增殖、迁移与侵袭的影响

程 晔， 胡巧珍， 陈淑勤， 黄爱民

食管癌位居我国恶性肿瘤发病率的第6位、肿瘤死因的第4位[1]。食管癌中绝大部分类型为食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma, ESCC)，预后差，5 a生存率仅20%[2-3]。

microRNAs(miRNAs)是一类长约22个核苷酸的非编码RNA[4]。研究发现，miRNAs参与食管癌的增殖、凋亡、侵袭、转移、耐药等多个过程[5-7]，如miR-99b/let-7e/miR-125a这一miRNA簇能够被ZEB1(E盒结合锌指蛋白1)所诱导进而促进ESCC的侵袭和转移[8]，miR-338-5p能靶向FERMT2抑制ESCC细胞的增殖、菌落形成、迁移和顺铂耐药[7]。

miR-581是新近发现的miRNA。研究发现，miR-581在肝癌和结直肠癌中表达下调，过表达miR-581可抑制结直肠癌SW620细胞的侵袭和转移[9-10]、抑制非小细胞肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭[11]。笔者拟检测miR-581在食管癌组织中的表达情况及miR-581对ESCC K30细胞增殖、迁移和侵袭的影响，为探讨ESCC恶性进展的分子机制提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 选取2013年2月—2014年2月经手术治疗的ESCC患者33例，手术中将切除的癌组织及其配对癌旁组织放置于液氮中保存。本研究获取的组织标本经过医院伦理审查委员会审批并取得患者知情同意。K30细胞(人ESCC细胞KYSE30)为本实验室保存(中山大学附属肿瘤医院关新元教授惠赠)。miR-581 mimic转染ESCC细胞K30作为实验组，用阴性对照片段转染K30作为阴性对照组(negatitive control，miR-581-NC组)。

1.2主要试剂及材料 DMEM细胞培养基和胎牛血清(美国Gibco公司)，Transwell小室及Transwell铺胶小室(美国BD公司)，CCK8试剂盒(美国MCE公司)，Lipofectamime2000(美国Invitrogen公司)，逆转录试剂盒(RR037A，日本TakaRa公司)，SYBR green 荧光染料(美国Bio-Rad公司)。miR-581-mimic及其NC组、miR-581引物及内参U6引物均购自广州锐博生物科技公司。

1.3细胞培养及转染 培养液为含10%胎牛血清的DMEM，置于37 ℃、体积分数为0.05的CO2恒温培养箱中培养。将处于对数生长期的ESCC细胞接种于6孔板内，待细胞融合度为60%时，采用Lipofectamime2000进行转染，6 h后更换含血清的正常培养基继续培养或用于后续实验。

1.4实时荧光定量PCR(qPCR)检测组织及ESCC细胞中miR-581的表达 采用Trizol试剂提取组织或细胞中的总RNA，逆转录合成cDNA。扩增体系采用Universal SYBR Green Supermix 5 μL，上下游引物各0.5 μL，模版cDNA 1 μL，加无核酶水至10 μL。采用2-ΔΔCt法计算miR-581的相对表达量。

1.5CCK8检测细胞的增殖能力 96孔板每孔加入密度为5×103mL-1的细胞悬液200 μL，设置 5个复孔。待细胞贴壁后，分别在0，24，48，72，96，120 h弃去待测孔的培养液，加入10 μL CCK-8及90 μL培养液，孵育2 h后酶标仪检测OD450值，绘制细胞生长活力曲线。

1.6Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力 Transwell迁移实验采用不铺胶的小室，Transwell侵袭实验采用预制胶包被的小室。Transwell上室中加入细胞密度为8×104mL-1的无血清细胞悬液200 μL，下室加500 μL含10%FBS的DMEM。接种12 h后收集Transwell小室，甲醇固定15 min、0.1%结晶紫染色20 min，1×PBS缓冲液洗涤3次，用棉签擦掉上室内侧未穿过小室的细胞，小室倒置于显微镜下，随机选择5个视野进行拍照计数。

1.7统计学处理 采用GraphPad Prism 6统计软件处理，ESCC组织与相应的癌旁组织中miR-581的表达差别采用配对t检验，两组间比较采用Student′st检验，P<0.05为差别具有统计学意义。

2 结 果

2.1癌组织及癌旁组织中miR-581的表达结果 qPCR检测33对ESCC和癌旁组织中miR-581的表达水平。结果显示，ESCC组织中miR-581的表达水平低于相应的癌旁组织，差别有统计学意义(P<0.01，图1)。

与癌旁组织比较，△△：P<0.01.图1 q-PCR检测食管鳞癌和癌旁组织中miR-581的表达情况Fig 1 The expression of miR-581 in ESCC and the adjacent normal tissues was detected by q-PCR

2.2转染miR-581-mimic后各组细胞miR-581的表达 ESCC细胞K30转染miR-581-mimic后，qPCR检测结果显示，与miR-581-NC组比较，miR-581的表达在miR-581-mimic组显著上升(P<0.01)，提示miR-581转染成功(图2)。

miR-581-NC：阴性对照组；miR-581-mimic：转染miR-581-mimic组. 与miR-581-NC组比较，△△：P<0.01.图2 PCR检测转染miR-581-mimic后K30细胞miR-581的表达水平Fig 2 The expression levels of miR-581 in K30 cells after transfection with miR-581-mimic were detected by q-PCR

2.3过表达 miR-581对ESCC细胞增殖能力的影响 为检测miR-581对ESCC细胞增殖能力的影响，将miR-581-mimic转染K30细胞。CCK8细胞增殖实验结果显示，从第72小时开始，与miR-581-NC组比较，miR581-mimic组细胞的增殖能力明显下调(P<0.05，图3)。

miR-581-NC：阴性对照组；miR-581-mimic：转染miR-581-mimic组. 与miR-581-NC组比较，△：P<0.05，△△：P<0.01.图3 转染miR-581-mimic后K30细胞的增殖情况Fig 3 The proliferation of K30 cells after transfection with miR-581-mimic

2.4过表达miR-581对ESCC细胞迁移及侵袭能力的影响 为检测miR-581对ESCC细胞迁移及侵袭能力的影响，将miR-581-NC和miR-581-mimic分别转染K30细胞。Transwell迁移及侵袭实验结果显示，与miR-581-NC组比较，转染miR-581-mimic后，miR-581-mimic组穿膜的细胞数显著减少，差别具有统计学意义(P<0.01，图4)。

A：显微镜下图片(结晶紫染色 ×100)；B：统计分析结果. miR-581-NC：阴性对照组；miR-581-mimic：转染miR-581-mimic组. 与miR-581-NC组比较，△△：P<0.01.图4 Transwell检测转染miR-581-mimic后K30细胞的迁移及侵袭情况Fig 4 The migration and invasion abilities of K30 cells transfected with miR-581-mimic were analyzed by Transwell assay

3 讨 论

miR-581是新近发现的microRNA，在肝癌和结直肠癌中表达下调[9-10]。本研究结果显示，miR-581在ESCC组织中表达显著低于其相应的癌旁组织，与Zhang等的研究结果较为一致[9]。

研究报道，miR-581在肿瘤的进展中发挥着一定的作用[10-12]。过表达miR-581可抑制结直肠癌侵袭和转移[10]。在非小细胞肺癌A549细胞中，过表达miR-581可抑制A549细胞的增殖、迁移和侵袭[11]。本研究通过转染miR-581 mimic使K30细胞过表达miR-581，探讨其对K30细胞生物学特性的影响，结果发现，上调miR-581的表达可抑制K30细胞的增殖能力、迁移及侵袭能力，说明在食管癌的发生发展过程中，miR-581可能发挥着抑癌基因的作用。

本研究初步证实了miR-581能够抑制ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力，但尚未探索miR-581调控ESCC K30细胞的具体机制。文献报道，miR-581能与PRDX1 3’UTR特异性结合，抑制PRDX1蛋白表达，从而抑制结直肠癌的增殖和侵袭[10]。在结直肠癌SW620细胞中过表达miR-581后，MMP-1和MMP-9表达水平下降，说明miR-581可能通过抑制MMP的表达而抑制肿瘤的侵袭和转移[12]。Zhang等根据miRTarBase数据库对miR-581的下游靶基因进行预测，发现MAP4K3，MAP4K4，SLC1A3及ZNF131等可能是其靶基因[9]。然而，miR-581抑制ESCC K30细胞的增殖、迁移和侵袭是否与这些基因有关，有待进一步的深入研究。