调心通督法对血管性痴呆大鼠学习记忆能力及海马区bFGF表达的影响

高音来　陈芯仪　何灏龙　郑慧娥　朱钰　谭涛　陈楚淘　田浩梅

〔摘要〕 目的 探討调心通督法对血管性痴呆（vascular dementia，VD）大鼠学习记忆功能及海马碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）表达的影响。方法 SD大鼠行Morris水迷宫实验筛选出特异性大鼠后随机分出6只假手术组，其余大鼠采用双侧颈总动脉永久性结扎法（2-VO）复制VD大鼠模型，造模后再按随机数字表法分为模型组、西药对照组、调心通督法针刺组，每组6只。于造模成功后及治疗后分别采用Morris水迷宫实验观察大鼠学习记忆能力，Western Blot法检测双侧海马bFGF蛋白表达。结果 造模后，与假手术组比较，各组大鼠平均逃避潜伏期时间明显增加，且找到平台次数明显减少（P<0.01）。治疗后，与模型组相比，西药对照组、调心通督法针刺组平均逃避潜伏期明显缩短（P<0.01），穿越原平台次数增加（P<0.05）;与西药对照组比较，调心通督法针刺组差异不具有统计学意义（P>0.05）。与假手术组比较，各组大鼠海马区bFGF表达均升高（P<0.01）;与模型组比较，西药对照组及调心通督法针刺组海马bFGF表达均明显增高（P<0.05）。结论 调心通督法能明显改善VD大鼠学习记忆能力、上调海马bFGF表达，可能是其重要作用机制之一。

〔关键词〕 血管性痴呆;调心通督法;碱性成纤维细胞生长因子;学习记忆

〔中图分类号〕R246.6       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.01.019

〔Abstract〕 Objective To explore the effects of Tiaoxin Tongdu method on learning and memory function and basic fibroblast growth factor （bFGF） expression in hippocampus of vascular dementia （VD） rats. Methods SD rats were selected by Morris water maze test and then randomly divided into 6 sham operation groups. VD rat model was established by permanent ligation of bilateral common carotid artery （2-VO）. The other rats were divided into a model group， a western medicine control group and Tiaoxin Tongdu method acupuncture group according to the random number table method， with 6 rats in each group. Morris water maze test was used to observe the learning and memory ability of rats after successful modeling and after treatment. Western Blot method was used to detect the expression of bFGF protein in bilateral hippocampus. Results Compared with sham operation groups， the average escape latency time of rats in each group increased significantly， and the number of platforms found decreased significantly （P<0.01）. Compared with the model group， the average escape latency was significantly shortened （P<0.01） and the number of times crossing the original platform was increased （P<0.05） in the western medicine control group and the Tiaoxin Tongdu method acupuncture group. Compared with the western medicine control group， the difference of the Tiaoxin Tongdu method acupuncture group was not statistically significant （P>0.05）. Compared with the sham operation groups， the expression of bFGF in hippocampus of each group was increased （P<0.01）. Compared with the model group， the expression of bFGF in hippocampus of the western medicine control group and the Tiaoxin Tongdu method acupuncture group increased significantly （P<0.05）. Conclusion Tiaoxin Tongdu method can significantly improve the learning and memory ability of VD rats， and up-regulation of bFGF expression in hippocampus may be one of its important mechanisms.

〔Keywords〕 vascular dementia; Tiaoxin Tongdu method; basic fibroblast growth factor; learning and memory

血管性痴呆（vascular dementia，VD）是主要由长期慢性低灌注的颅内血管疾病所致的记忆障碍综合征。随老龄化社会的到来，血管性痴呆的发病率逐年递增[1]。該病严重影响着患者自身、家庭乃至整个社会，预防及医治VD已被世界卫生组织列为21世纪重点科研项目之一[2-3]。前期临床研究[4]表明由名老中医严洁教授提出以心包经和督脉为主的“调心通督”法能提高VD患者简易智力状态检查（mini-

mental state examination，MMSE）评分，改善其自理能力，提示慢性低灌注脑组织的保护、修复过程与调心通督法相关，但其作用机制尚待探讨。

碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）是一种能作用于体内及体外的多效性血管生长因子[5-6]，作为主要的血管生长因子之一，对促进细胞有丝分裂、血管生成、神经修复、创面愈合及内皮细胞新生具有不可替代的调节作用[7-9]。陈倩倩[10]、唐强[11]、王亚军等[12]均观察到针刺可通过上调bFGF的表达来促进脑缺血区的血管新生。因此，本实验研究将从重要的血管新生因子bFGF着手，观察调心通督法对VD大鼠学习记忆能力的改变及bFGF蛋白的表达情况，探讨调心通督法医治VD的作用机制，为今后针灸治疗VD提供充分的理论和实验支持。

1 材料与方法

1.1  实验动物及分组

45只SPF级雄性SD大鼠，体质量控制在200～250 g，购自湖南中医药大学动物实验中心，许可证号：SCXK（湘）2016-0002，合格证号：43004700057075。将大鼠置于SPF级动物实验房饲养，保持室温20～22 ℃，湿度50%～60%，饮食、饮水自由，喂养及治疗期间隔天清洗笼盒及更换垫料，水迷宫实验期间每天清洗并更换。适应性喂养1周，行Morris水迷宫实验后筛选出特异性大鼠，保留43只，按随机数表法选出6只为假手术组，其余大鼠造模后行水迷宫实验检测，筛选出造模成功的VD大鼠18只，分为模型组、西药对照组、调心通督法针刺组，6只/组。实验过程中大鼠死亡时，剔除并补录，统一为发现情况的第2日上午采取签盒抽签的方式进行补录。本实验大鼠死亡率约为50%。实验动物处理的伦理学依据参照中华人民共和国科学技术部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2  主要试剂与仪器

10%水合三氯乙醛（长沙-维尔生物科技有限公司），络合碘（长沙-欧润消毒科技有限公司），注射用青霉素钠（江西-科达动物药业有限公司），ABclonal抗体（北京-鼎国生物技术有限公司），安迪牌0.30 mm×25 mm无菌针灸针（贵州-安迪药械有限公司），Morris水迷宫视频分析系统（法国View-point公司），电子天平（杭州-恒仪仪表科技有限公司）。

1.3  动物模型复制与评定标准

所有大鼠术前12 h禁食，不禁水。除假手术组外，其余各组采用双血管阻断法[13]（2-VO）模拟VD模型，用10%的水合三氯乙醛（0.3 mL/100 g）将大鼠麻醉后固定于鼠板上，待备皮、消毒后沿颈部中央前方逐层分离皮肤及皮下组织，依次暴露双侧颈总动脉，以4～0号线分别于近心端与远心端结扎并从中间剪断，伤口内撒入适量青霉素，以3～0号线缝合皮肤。注意手法柔和、无菌操作。假手术组操作方法一致，但不结扎剪断双侧颈总动脉。

模型成功的判断标准[14]：造模2周后行Morris水迷宫实验，以假手术组作参照，计算各造模组大鼠逃避潜伏期分别与假手术组逃避潜伏期平均值之差占该鼠平均逃避潜伏期的比值，若该值大于20%，则为血管性痴呆模型。

1.4  各组干预方法

假手术组和模型组：只捆绑，不给药，不针刺。调心通督针刺组：根据《实验针灸学》及华兴邦《实验动物图谱》，选取“命门”“大椎”直刺5 mm，“风府”向下斜刺5 mm，“百会”“神庭”平刺10 mm，“水沟”向鼻中隔方向斜刺2 mm，“内关”直刺5 mm，“大陵”“劳宫”直刺2 mm;不给药，捆绑后针刺，采取平补平泻手法，留针30 min。西药对照组：予尼莫地平（0.0625 g/kg）与蒸馏水混合至0.01 g/mL灌胃，给药后捆绑，不针刺。各组干预1次/d，持续2周。

1.5  Morris水迷宫行为学检测

Morris水迷宫[15]外形为一圆形水池，分为4个象限，任一象限中央可放置直径10 cm低于水面2 cm的无色透明平台。前5天为定位航行试验：每天固定时段训练4次，设定时限为120 s，将大鼠四肢完全站上平台耗时，记为“逃避潜伏期”。前2天作为大鼠适应期，不计入成绩，最终以第3天到第5天平均耗时作为其有效成绩。第6天为空间探索试验：撤除小平台，任选同一象限将大鼠放入水中，测出120 s内大鼠经过平台区域次数。

1.6  脑组织取材及指标检测

各组大鼠先以10%的水合三氯乙醛（0.3 mL/100 g）进行腹腔注射麻醉后迅速断头取脑，再将双侧海马分离放入标记好编号的EP管中，置于干冰箱中低温保存，随后移至-80 ℃冰柜冻存，采取Western Blot检测法进行样品制备。

Western Blot法检测海马中bFGF蛋白表达：按比例将海马组织加入裂解液，提取海马总蛋白。进行蛋白定量取上清液用BCA蛋白定量试剂盒，计算出蛋白浓度。采用10%分离胶和5%浓缩胶行SDS-PAGE电泳，NC膜转移，转膜后在室温摇晃闭存1 h，之后加入一抗（兔多抗），4 ℃孵育一宿，TBST洗膜，5 min×4次;将膜转入二抗（兔多抗），室温孵育1 h，TBST洗膜，5 min×5次;用化学发光法（ECL）显影，扫描、存档，Image-J软件测出各条带灰度值进行分析。

1.7  统计学方法

实验数据应用SPSS 22.0统计软件进行分析，对所有数据均使用“x±s”表示。水迷宫实验数据采用重复测量方差分析，多组间比较可用单因素方差分析（One-way ANOVA），以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  定位航行实验-逃避潜伏期时长

组间比较：造模前，各组大鼠平均逃避潜伏期差异无统计学意义（P>0.05）。造模后，与假手术组比较，各组大鼠平均逃避潜伏期时间明显增加（P<0.01）。治疗后，与模型组相比，西药对照组、调心通督法针刺组平均逃避潜伏期明显缩短，差异有统计学意义（P<0.01）;与西药对照组比较，调心通督法针刺组差异无统计学意义（P>0.05）。组内比较：假手术组造模前、造模后及治疗后两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与造模前比较，造模后与治疗后模型组平均逃避潜伏期时间明显增加（P<0.01）;与造模后比较，治疗后模型组平均逃避潜伏期时间差异无统计学意义（P>0.05）。与造模前比较，造模后西药对照组、调心通督法针刺组平均逃避潜伏期时间明显增加（P<0.01），治疗后西药对照组、调心通督法针刺组平均逃避潜伏期时间差异无统计学意义（P>0.05）;与造模后比较，西药对照组、调心通督法针刺组平均逃避潜伏期缩短，差异有统计学意义（P<0.01）。见图1、表1。2.2  空间探索实验-穿越平台次数

组间比较：造模前，各组大鼠穿越平台次数差异无统计学意义（P>0.05）。造模后，与假手术组比较，各组大鼠穿越原平台次数明显减少（P<0.01）。治疗后，与模型组相比，西药对照组、调心通督法针刺组穿越原平台次数增加，差异有统计学意义（P<0.05），与西药对照组比较，调心通督法针刺组差异无统计学意义（P>0.05）。组内比较：假手术组造模前、造模后及治疗后两两比较差异均无统计学意义（P>0.05）。与造模前比较，造模后与治疗后模型组穿越原平台次数明显减少（P<0.01）;与造模后比较，治疗后模型组穿越原平台次数差异无统计学意义（P>0.05）。与造模前比较，造模后西药对照组、调心通督法针刺组穿越原平台次数明显减少（P<0.05），治疗后西药对照组、调心通督法针刺组穿越原平台次数差异无统计学意义（P>0.05）;与造模后比较，西药对照组、调心通督法针刺组穿越原平台次数增加，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.3  各组大鼠海马区bFGF蛋白的表达情况

与假手术组比较，造模组大鼠海马区bFGF蛋白表达明显增加（P<0.01）;与模型组比较，西药对照组、调心通督法针刺组海马bFGF蛋白表达均明显增高（P<0.05或P<0.01）;西药对照组与调心通督针刺组比较差异无统计学意义（P>0.05）。见图2、表3。

3 讨论

中医古籍中血管性痴呆多属于“痴呆”“呆病”的范畴，其病位在脑，头为“清阳之腑”，脏腑之精血清气皆上注入脑，而督脉的循行与其密切相关。心为“君主之官”，因心包络作为脂膜护卫心于外，说明心包经协助心经完成心主血脉、主神明之功。因此心包代心受邪，故治疗以心包经与督脉为主。“调心通督”法为名老中医严洁教授多年来的临床和科研实践总结，以督脉上“百会”“神庭”“大椎”“风府”“水沟”“命门”，配以心包经上“内关”“大陵”“劳宫”等穴，达到醒脑开窍、清利头目、平衡阴阳等作用，其临床疗效显著。

本研究实验发现，造模后与假手术组比较，各组大鼠平均逃避潜伏期时间明显增加，且找到平台次数明显减少，说明造模组耗时长，学习记忆能力下降，提示VD大鼠模型制备成功。治疗后与模型组相比，药物及针刺组平均逃避潜伏期明显缩短，穿越原平台次数增加，与西药对照组比较，调心通督法针刺组差异不显著，提示西药、针刺均能明显改善VD大鼠的学习记忆能力，且治疗效果旗鼓相当。组内间与造模后比较，治疗后调心通督法针刺组平均逃避潜伏期缩短，穿越原平台次数增加，说明调心通督法治疗VD大鼠疗效肯定。bFGF是最为有效的血管生长因子之一，可增强内皮细胞黏附迁移、分裂增殖、促进血管新生。大量实验研究表明[16-17]bFGF是血管发生的启动因子，能修复毛细血管，使血管得以再生或重塑，并能刺激VEGF的增殖，上调血管内皮细胞生长因子发挥作用[18-20]，共同促进血管生成。与假手术组比较，造模组大鼠海马区bFGF蛋白表达明显增加;与模型组比较，西药对照组、调心通督法针刺组海马bFGF蛋白表达均明显增高，有显著性差异，但两组差异无统计学意义。本实验说明通调心通督法可促进VD大鼠海马区bFGF蛋白的表达，从而实现血管的修复与再生，提高其学习记忆能力。

综上所述，调心通督法针刺VD大鼠可以改善其学习记忆能力可能与增加海马区bFGF蛋白表达有关。它作为具有中医特色的针刺疗法，不仅得到验证其临床疗效好，且相比目前其它治疗其不良反应小、安全性高，具备多方面临床治疗优势。本实验从动物实验研究调心通督法治疗VD的作用机制，以便更好的为临床针刺治疗VD提供客观的实验依据，值得加快推广应用。

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（本文編辑  匡静之）