对2015 年版《中国药典》中茜草定量测定方法的改进

杨 丽

（白银市药品检验检测中心，甘肃 白银 730900）

茜草系茜草科植物茜草Rubia cordifoliaL.的干燥根和根茎，随着人们对中医药事业的关注度日益提高，其药用价值也日益显现［1-4］。2010、2015 年版《中国药典》茜草中羟基茜草素、大叶茜草素的含有量测定方法采用一次过夜超声、二次化学反应提取后HPLC 法定量分析。但前期发现，在供试品溶液制备过程中一次提取方法的选择、滤液的收集装置、二次化学反应的提取方法、装置等问题值得商榷。本实验参照文献［5-7］，考察了供试品溶液制备过程中是否需要浸泡过夜、回流与水浴加热净化效果比较，以期为茜草质量控制提供参考依据。

1 材料

1.1 试剂与药物 茜草来自甘肃省2019 年省评抽检任务，经白银市药品检验检测中心苏学秀副主任中药师鉴定为正品。大叶茜草素（批号110884-201606，纯度99.5%）、羟基茜草素（批号111898-201603，纯度98.5%）对照品均购自中国食品药品检定研究院。磷酸、甲醇、乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为自制超纯水。

1.2 仪器 MSA 125P-1CE-DA 电子分析天平（德国赛多利斯公司）；EL204-IC 电子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Agilent 1260 高效液相色谱仪，配置VWD 紫外检测器（美国Agilent 公司）；恒温水浴锅。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），其他同2015 年版《中国药典》（柱温35 ℃；体积流量1 mL/min；进样量20 μL），色谱图见图1。

2.2 对照品溶液制备 参照2015 年版《中国药典》方法制备，即得。

2.3 供试品溶液制备 取药材（过2 号筛）约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入100 mL 甲醇，密塞，称定质量，超声（250 W、40 kHz）处理30 min，放冷至室温，甲醇补足减失的质量，滤过，精密吸取续滤液50 mL与具塞锥形瓶中，蒸干，精密加入甲醇-25% 盐酸（4∶1）20 mL，70 ℃下回流提取30 min，取出，立即冷却，精密加入3 mL 三乙胺，立即盖上瓶塞，匀速振摇后静置30 min，转移至25 mL 量瓶中，甲醇少量多次洗涤容器内壁，洗液并入量瓶中，定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 重复性试验 取同一批药材6 份，每份0.5 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定6 次，测得羟基茜草素、大叶茜草素含有量RSD 分别为1.5%、0.9%，表明该方法重复性良好。

2.5 精密度试验 精密吸取 “2.2”项下对照品溶液20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定6 次，测得羟基茜草素峰面积RSD 为1.2%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取2.4”项下供试品溶液1 份，室温下于0、5、10、15、20、25 h 在“2.1”项色谱条件下各进样20 μL，测得羟基茜草素、大叶茜草素峰面积RSD 均为0.9%，表明供试品溶液在25 h 内稳定性良好。

2.7 样品含有量测定 取药材粉末（过2 号筛），每批各2 份，分别按“2.3”项下方法和2015 版《中国药典》方法制备供试品溶液，精密吸取对照品、供试品溶液各20 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，外标法计算含有量，结果见表1。

图1 各成分HPLC 色谱图

3 讨论

在一次提取阶段，本实验选择甲醇、甲醇-25% 盐酸（4∶1）作为溶剂［5-7］，超声（250 W、40 kHz）处理30 min、浸泡过夜后超声（250 W、40 kHz）处理30 min、加热回流30 min、浸泡过夜后加热回流30 min作为提取方法，正交试验进行筛选，最终确定最优方法为甲醇超声（250 W、40 kHz）处理30 min。考虑到后续研究中蒸干容器对实验的重要影响，又考察了具塞锥形瓶、烧杯、蒸发皿，发现具塞锥形瓶蒸干效果最好。二次提取容器与一次提取相同，能大大减少因残渣溶解不完全或转移过程中洒漏而导致的偶然误差。

在二次反应阶段，本实验比较了水浴上直接敞口加热水解、回流加热水解，确定为70 ℃下加热回流水解，可节省检验时间，避免溶剂挥发，减少检验难度，提高实验效率。2015 年版《中国药典》对加入三乙胺后的混匀时间未作出规定，而本实验发现加入3 mL 三乙胺后混匀30 min即可反应完全，但此时由于发生化学反应，具塞锥形瓶中会产生大量白烟，故应及时盖上瓶塞以确保反应完全发生。另外，反应液转移至量瓶后加甲醇少量多次润洗容器内壁，洗液并入量瓶中用甲醇定容时，成分含有量更高。

表1 各成分含有量测定结果（n=10）

综上所述，2015 年版《中国药典》茜草中羟基茜草素、大叶茜草素含有量测定方法值得商榷。近年来，学者对茜草主成分含有量［8-9］及其指纹图谱［10-12］进行了研究，并标定了10～15 个色谱峰。本实验通过与HPLC 色谱图比对，发现随着pH 变化大叶茜草素、羟基茜草素之间会相互转化，故分别对两者制订标准并不能全面评价茜草质量。因此，建议在2015 年版《中国药典》中茜草含有量测定方法的供试品溶液制备项下，应对一次提取方法、滤液收集装置、二次化学反应条件、加三乙胺后混匀时间、反应液转移至量瓶是否需要冲洗等内容进行修订，并将羟基茜草素、大叶茜草素总含有量作为指标以使相关标准更准确、可靠、完善。