柴芍安神解郁颗粒对脑卒中后抑郁的影响

李钰婷 ，甘海宁，赵自明，占心佾，郭 鸣，李智勇，陈玉兴*

（1.广州中医药大学 第五临床医学院，广东 广州 510405；2.广东省中医药工程技术研究院 广东省中医药研究开发重点实验室，广东 广州 510095）

卒中后抑郁（post-stroke depression，PSD）是一种卒中的常见并发症，其病因、病理和机制复杂，可导致神经、心理、精神和情感等障碍。有研究表明，卒中幸存者超过30%患有PSD，且发病率和死亡率呈增加趋势［1-2］。柴芍安神解郁颗粒为广东省第二中医院的院内制剂，由醋柴胡、白芍、香附、郁金、石菖蒲、法半夏、丹参、茯苓、酸枣仁、牡蛎组成，主要用于PSD 的治疗，临床应用多年取得较好疗效。本研究主要观察柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠PI3K/Akt/RPS6K 信号通路和下丘脑-垂体-肾上腺轴（Hypothalamic-Pituitary-Adrenal axis，HPA）通路的调控作用，初步探讨柴芍安神解郁颗粒抗PSD 的作用机制，为临床用药提供实验依据。

1 材料

1.1 动物 雄性SD 大鼠，SPF 级，购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号SCXK（粤）2013-0002，质量合格证号44007200026770。动物实验设施使用许可证号SYXK（粤）2015-0059。

1.2 药物与试剂 柴芍安神解郁颗粒由广东省中医药工程技术研究院制剂研究室制备（批号20170802）；百优解（氟西汀胶囊，批号6621A）购自法国Patheon 公司；解郁安神颗粒（批号17092521）购自神威药业有限公司；水合氯醛（批号20120611）购自成都市科龙化工试剂厂；大鼠促肾上腺皮质激素释放激素（CRH，批号229180412）、促肾上腺皮质激素（ACTH，批号120180412）、皮质醇（CORT，批号230180412）酶联免疫（ELISA）试剂盒购自天津安诺瑞康生物技术有限公司产品；抗PIK3R5（批号E807AA0002）、Akt 1（批 号E803AD0275）和RPS6KA1（批号D905AA1021）抗体购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 仪器 JJ3000 动物电子秤（G＆G 公司）；BS224S 电子天平（万分之一）（德国Sartorius 公司）；5424 型小型高速离心机（德国Eppendorf 公司）；-80 ℃超低温冰箱（美国Thermo 公司）；680 酶标仪、PowerPac Basic 电泳仪、Mini-protean Teral Cell 垂直电泳槽、制胶器（美国Bio-Rad公司）；Tanon5200 Multi 多功能成像系统（上海天能科技有限公司）；GS-20 轨道式摇床（杭州米欧仪器有限公司）。

2 方法

2.1 药物制备 柴芍安神解郁颗粒是广东省第二中医院应用十余年，用于治疗中风后抑郁症的经验方剂，主要由醋柴胡150 g、白芍150 g、香附150 g、郁金150 g、石菖蒲150 g、法半夏120 g、丹参120 g、茯苓120 g、酸枣仁120 g、牡蛎120 g 组成，将香附、石菖蒲、郁金等提取挥发油后，药渣与其余药材加8 倍量水提取2 次，1.5 h/次，合并滤液，浓缩至相对密度1.10～1.20（60 ℃）清膏，喷雾干燥成细粉，加入适量麦芽糊精和甜菊素，干压制粒，喷入挥发油，混匀即可。根据日服生药材剂量为58 g，总出膏率平均为20.22%，得浸膏11.73 g，按日服用2 次，每次5.86 g 浸膏粉，每袋装8 g，浸膏粉与辅料配比约为10∶3.65。制备工艺请参考文献［3］。

2.2 造模、分组及给药 大鼠采用线栓法复制大脑中动脉栓塞（MCAO）局灶性脑缺血再灌注模型，在缺血2 h 后拔出线栓造成脑缺血再灌注损伤；缺血再灌注7 d 后，造模组大鼠随机均分为模型组、氟西汀胶囊组（1.80 mg/kg，临床等效剂量）、解郁安神颗粒组（0.90 g 生药/kg）、柴芍安神解郁颗粒高剂量组（11.52 g 生药/kg，2 倍临床等效剂量）和柴芍安神解郁颗粒低剂量组（5.76 g 生药/kg，临床等效剂量）5 组。各给药组按剂量灌胃给药，正常对照组、模型组灌胃给予等容量蒸馏水，每日1 次，连续8 周。同时，除正常对照组外其余各组大鼠每天采用慢性不可预测应激（CUMS）处理［4］。

2.3 指标检测

2.3.1 旷场试验 8 周后，各组大鼠置于80 cm×80 cm×40 cm、面白线画有25 块16 cm×16 cm 正方形色方格，内壁为黑色的箱内进行旷场试验［5］，记录各组水平运动及垂直运动得分。

2.3.2 CRH、ACTH、CORT 检测 末次给药后1 h，10%水合氯醛麻醉，腹主动脉取全血，分离血清，ELISA 测血清CRH、ACTH、CORT 水平；

2.3.3 海马组织PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白检测 采用Western blot 法。取大鼠脑组织，冰台上迅速分离海马组织。取0.1 g 组织于冰上研磨，加入1 mL 裂解液，充分裂解，12 000 r/min，4 ℃，离心10 min，用BCA 法检测蛋白浓度后，按照60 μg 蛋白上样量进行计算，煮蛋白，进行SDS-PAGE 凝胶电泳。转膜封闭后，加入PI3K、Akt、RPS6KA1（1∶1 000 稀释）孵育，4 ℃过夜；回收一抗，洗涤液洗3 次，二抗孵育1 h，回收二抗，洗涤液洗3 次。将PVDF 膜置于化学发光液中浸泡1～2 min，ECL 发光显色，用凝胶自动成像系统对印迹区带进行拍摄，用Image J软件进行半定量分析。

2.4 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行分析，计量资料以（）表示。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK 检验；方差不齐时改用Dunnett’s T3 检验。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠旷场试验得分的影响见表1。与正常对照组比较，模型组大鼠水平运动和垂直运动得分均减少（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组大鼠水平运动得分、垂直运动得均增加（P＜0.01）。

表1 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠旷场试验得分的影响（，n=10）

表1 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠旷场试验得分的影响（，n=10）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.2 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠血清CRH、ACTH、CORT 水平的影响 见表2。与正常对照组比较，模型组大鼠血清中CRH、ACTH、CORT 水平均升高（P＜0.01）；与模型组比较，各药物组血清CRH、ACTH、CORT 均降低（P＜0.05，P＜0.01）。

表2 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠血清中CRH、ACTH、CORT 水平的影响（，n=10）

表2 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠血清中CRH、ACTH、CORT 水平的影响（，n=10）

注：与正常对照组比较，##P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠海马组织BDNF 的影响 表3 表明，与正常对照组比较，模型组大鼠海马BDNF水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，柴芍安神解郁颗粒高、低剂量组大鼠海马BDNF 水平均增加（P＜0.01）。

表3 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠海马组织BDNF 水平的影响（，n=10）

表3 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠海马组织BDNF 水平的影响（，n=10）

注：与正常对照组比较，##P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.4 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠海马组织PI3K/Akt/RPS6KA1 信号通路蛋白表达的影响 见表4、图1。与正常对照组比较，模型组大鼠海马PI3K 蛋白表达无变化（P＞0.05），Akt 蛋白表达降低（P＜0.05），RPS6KA1 蛋白表达增加（P＜0.01）；与模型组相比，各组大鼠海马Akt和RPS6KA1 均有显著性增加（P＜0.01）。

表4 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠海马PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白表达的影响（，n=3）

表4 柴芍安神解郁颗粒对PSD 大鼠海马PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白表达的影响（，n=3）

注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

图1 Western blot 检测大鼠海马PI3K、Akt、RPS6KA1 蛋白表达

4 讨论

“卒中”是一种急性脑血管疾病，又称“中风”“脑血管意外”，是由于脑部血管突然破裂或阻塞而引起的脑组织损伤。卒中发生后通常会导致PSD，而PSD 发生的原因复杂，分析其原因主要由于卒中严重损害大脑的生理结构，影响其正常的调节情绪功能。有研究［6］发现，左侧大脑半球梗死后抑郁发病率高于右侧半球，说明左侧大脑半球病变更易引起抑郁状态，以及患者对自身疾病所带来身心生理生活及经济负担上的焦虑，严重影响情绪，甚至产生轻生现象等。柴芍安神解郁颗粒作为广东省第二中医院的院内制剂，具有疏肝解郁及活血化瘀等功效，多年临床应用已证实该制剂具有显著改善PSD 的疗效，但是该方治疗PSD 的作用机制尚未阐明。因此，本研究拟从情绪应激及内分泌相关的HPA 轴、神经营养因子及其下游信号通路的角度探讨其改善PSD 的作用机制。我们的研究发现柴芍安神解郁颗粒明显升高PSD 模型大鼠的抑郁症状，其作用机制与调节大脑海马神经元保护有密切关系。

不少研究表明，PSD 的发生、发展与HPA 轴的异常有密切关系。当机体感受应激源时，HPA 轴兴奋性升高，肾上腺分泌的糖皮质类固醇升高，从而使机体适应应激。PSD 患者存在长期或慢性的抑郁应激状态与HPA 轴功能持续亢进有关，表现出促肾上腺皮质激素释放激素（Corticotropin-Releasing Hormone，CRH）、促肾上腺皮质激素（Adrenocorticotropic Hormone，ACTH）及肾上腺酮（Corticosterone，CORT）大量释放［7-9］。柴芍安神解郁颗粒明显降低PSD 大鼠血清CRH、ACTH 和CORT 的水平，提示其能降低中风后遗症引起的HPA 轴功能过度兴奋，从而改善PSD大鼠的抑郁症状。

脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）主要分布在海马和前皮质中，对神经系统发育发挥重要的作用，在本实验中，柴芍安神解郁颗粒明显升高海马组织中BDNF 的含量，结果提示其具有增强神经元的存活和联系的作用，而氟西汀和解郁安神颗粒并无此作用。同时，BDNF 也是与抑郁症高度相关的一个神经营养因子［10］，BDNF 缺失可能导致神经凋亡或萎缩，进而导致抑郁的发生。BDNF 与酪氨酸激酶B（Tyrosine kinase B，TrkB）结合后可激活细胞内多个信号传导通路，其中的磷酸肌醇3 激酶（Phosphoinositol 3 kinase，PI3K）传导通路通过与下游的靶标Akt 相结合，促进神经元细胞发育、分化、再生以及对神经元的存活、突触可塑性等发挥重要作用。当脑发生缺血时，PI3K/Akt 通道的激活可抵抗自由基、拮抗氨基酸神经毒性、平衡细胞内Ca2+水平、抑制神经细胞凋亡、促进血管内皮新生等，对抑制细胞凋亡有积极作用［11-4］。柴芍安神解郁颗粒明显增加PSD 大鼠脑内PI3K 和Akt 的蛋白表达，两者结合增多，从而在脑卒中时，增加神经元的存活。而氟西汀和解郁安神颗粒仅增加Akt 的表达量，PI3K 并无明显变化。核糖体蛋白S6 激酶α1（Ribosomal Protein S6 Kinase A1，RPS6KA1）是一类位于MAPK 激酶下游的高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，其介导某些特定前凋亡蛋白的失活或通过激活转录因子直接启动一些抗凋亡蛋白的合成，还能够通过磷酸化来使一些具有凋亡功能的细胞死亡蛋白和肿瘤抑制因子相关蛋白激酶失活［15］。柴芍安神解郁颗粒通过增加PRS6KA1 的蛋白表达量，从而增强神经元细胞抵抗凋亡的作用。

综上所述，柴芍安神解郁颗粒可明显增加PSD 大鼠水平运动得分和垂直运动得分，显著性降低PSD 大鼠CRH、ACTH、CORT 等HPA 轴激素水平，抑制HPA 轴功能兴奋性，以及上调海马BDNF 的含量及PI3K、Akt、RPS6KA1蛋白的蛋白相对表达量，从而减少脑神经元细胞的凋亡。该结果提示柴芍安神解郁颗粒改善PSD 大鼠抑郁症状可能与抑制PHA 轴兴奋性及激活PI3K/Akt/RPS6K 通路使脑神经元细胞免受凋亡有关。